论文部分内容阅读
猪血小板源生长因子受体α是酪氨酸蛋白激酶受体家族成员之一,在脂代谢中具有潜在的调控作用。本实验旨在克隆猪(Sus scrofa)血小板源生长因子受体αα基因PDGFRα的cDNA全长并分析其组织表达谱。根据GenBank上已登录的人(Homosapiens)、牛（BBos tαurus)和小鼠(Mus musculus)等物种的PDGFRα基因序列设计引物,利用反转录PCR以及RACE技术,克隆得到猪PDGFRα基因的cDNA序列。利用生物信息学软件比对多物种间核苷酸和氨基酸序列同源性,并预测猪PDGFRα蛋白的结构与功能。分析猪PDGFRα基因在三个不同品种(金华、杜洛克和大约克)中存在的多态性。利用实时荧光定量PCR(quantitativeReal-time,qRT-PCR)检测PDGFRα基因在杜洛克猪不同组织、不同部位肌肉、不同生长阶段以及不同品种中的表达水平。主要研究结果如下:1、猪PDGFRα基因克隆与测序测序结果分析表明,猪PDGFRα基因cDNA长度为6360 bp(GenBank登录号:KP329568),其中开放阅读框长度(open reading frame,ORF)为 3270 bp,3’ UTR 为 2964 bp,5’UTR为126bp,共编码1089个氨基酸。该基因在基因组中大约横跨148 Mb,包含23个外显子和22个内含子。2、PDGFRαα蛋白生物信息学分析序列同源性分析表明,猪PDGFRα基因的核苷酸和氨基酸序列与人(Homo sapiens)、牛(Bostaurus)、绵羊(Ovis aries)、小鼠(Musmusculus)的相似性较高,且与人、牛、羊的相似性高达90%以上。蛋白质结构预测发现,PDGFRα蛋白具有2个跨膜螺旋,10个N-连接糖基化修饰位点,75个磷酸化修饰位点以及1个信号肽结构,且N端存在较强的疏水区域,C端则表现出较强的亲水性。PDGFRα蛋白整体带负电,呈亲水性,属于膜结合蛋白。3、猪PDGFRα基因多态性分析分析PDGFRα基因在金华猪、杜洛克猪和大约克猪三个品种中的单核苷酸多态性(SNP)。测序结果共发现13个SNPs,其中有10个引起氨基酸发生改变。4、猪PDGFRα基因表达分析实时荧光定量PCR分析表明,该基因在杜洛克猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠和骨骼肌等脏器均有表达,其中脾脏表达量最高,肾脏、肺脏次之。该基因在不同部位骨骼肌(比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌、腓肠肌和眼肌)中表达分析显示,在以比目鱼肌为代表的慢肌中的表达要极显著高于在以眼肌为代表的快肌中的表达(P<0.01)。比较不同生长阶段PDGFRα基因的表达发现,初生阶段表达量极显著高于断奶和成年阶段(P<0.01)。比较品种间的表达差异发现,金华猪在不同肌肉(眼肌、比目鱼肌、冈上肌、股二头肌、腰小肌)中的表达要极显著高于杜洛克和大约克猪(P<0.01)。而在腓肠肌中金华猪的表达要显著高于大约克猪。本研究获得猪PDGFRα基因cDNA全长、不同品种中的多态性、组织表达规律以及在不同生长阶段、不同品种中的相对表达量,为进一步研究猪PDGFRα基因的功能奠定了基础。