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目的:明确大蒜素抑制肾癌细胞Ketr—3增殖的作用,初步探索该作用可能的机制,希望为药物治疗肾癌提供一种新的选择。
方法:①不同浓度的大蒜素溶液及不同作用时间处理对数生长期的人肾癌细胞株Ketr—3,用倒置显微镜每天观察细胞生长情况;②采用MTT比色法测量A570值,计算对照组和各实验组Ketr—3细胞的抑制率;③TUNEL法检测大蒜素诱导的肾癌细胞Ketr—3的凋亡;④应用流式细胞技术检测大蒜素作用后的Ketr—3细胞的细胞周期及细胞凋亡率的变化;⑤使用Caspase—3活性检测试剂盒,比色法测定Caspase—3活性的变化;⑥RT—PCR半定量检测大蒜素对Ketr—3细胞Caspase—3 mRNA的表达水平的影响。
结果:⑴形态学变化:大蒜素处理过的细胞可见细胞分裂相减少,部分细胞变圆,漂浮,折光性差,残存的贴壁细胞形态不规则,状态差,可见大量细胞及碎片漂浮于培养液中,并切上述情况随着药物作用时间的延而加重。⑵MTT法显示大蒜素可明显抑制Ketr—3细胞的增殖,并且随着浓度的增加和作用时间延长而增强。不加药组为对照组,实验组大蒜素浓度分别为5ug/ml,10ug/ml.20 ug/ml,30 ug/ml,40 ug/ml,当作用48h后细胞抑制率分别为(4.6±1.9)%,(11.0±1.7)%,(58.5±2.7)%,(79.4.±2.9)%,(91.0±1.4)%,不同剂量间比较,P<0.05。不加药组为对照组,20ug/mL大蒜素作用24h、48h、72h、96h后,细胞抑制率分别为(18.1±2.1)%,(51.4±5.3)%,(87.6±1.7)%,(93.5±0.8)%,不同作用时间比较,P<0.05。⑶TUNEL显示,与对照组相比,大蒜素处理组凋亡阳性细胞数明显上升,提示大蒜素可以明显诱导凋亡。⑷FCM提示,大蒜素诱导流式细胞图上出现亚二倍体“凋亡峰”,定量分析显示,浓度为20μ g/ml的大蒜素作用48h后,Ketr—3细胞凋亡率为18.5±5.6%与对照组2.6±0.2%的凋亡率比较均有显著差异(P<0.05);大蒜素促使Ketr—3细胞G0/G1期细胞比例下降,S期和G2/M细胞比例上升。⑸比色法检测Caspase—3活性提示,大蒜素作用48h、72h、96h,其A405分别为0.52±0.04,0.86±0.04,1.26±0.12,与对照组0.34±0.05比较,caspase—3活性显著升高(P<0.05)。⑹半定量RT—PCR显示,20ug/ml大蒜素作用48h,72h,96h,细胞caspase—3mRNA水平在48h时升高明显,为最高,然后随着作用时间的延长而降低,与对照组相比分别上调61%,17%,11%。
结论:①大蒜素可以显著抑制肾癌细胞株Ketr—3的增值,为肾癌的治疗提供一种新的可能的方法。②诱导凋亡是大蒜素抑制细胞增值的机制之一。③Caspase—3及细胞周期阻滞参与了大蒜素诱导的细胞凋亡。