家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫,同时也是鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的重要模式生物。它具有适中的体型、较短的生命周期以及较高的繁殖率等实验动物的特点,同时具有基因组框架图、精细图、分子标记连锁图谱、遗传变异图谱以及百余年经典遗传学所积累的完善的遗传背景。家蚕具有丰富的突变体资源,其类型主要涉及体色、体形、躯体附肢发育、变态发育、卵色、卵形、氨基酸代谢、致死以及茧色、茧形等,是研究鳞翅目昆虫的重要材料。昆虫的体色与其觅食、求偶、体温调节、躲避天敌、适应环境等均有着密切关系,研究其体色形成模式具有重要的生物学意义。在家蚕的突变体资源中,体色相关突变体所占比例最大。研究家蚕体色突变体的形成机制不仅有助于了解鳞翅目昆虫色素代谢相关基因及调控网络,还可能为家蚕重要的功能基因的利用提供新思路。本研究以家蚕典型的淡体色致死性突变白化(al)为研究对象,利用定位克隆技术成功分离鉴定了al突变的候选基因,并进行候选基因功能验证及表型形成机制分析。取得的研究结果如下：1.白化突变(al)的分子定位及候选基因筛查选用家蚕基因库的al突变和野生型大造为亲本,分别配制al突变的连锁分析材料BC1F和定位分析材料BC1M。鉴于经典遗传研究已将al突变基因座位定位于第5连锁群37.9cM,我们利用家蚕SSR连锁图谱第5连锁群上的18对SSR标记和新设计的60对染色体步移引物进行多态性筛选、连锁验证以及分子定位,最终将al突变的候选区域锁定在nscaf2674上的标记C24和D20之间400kb区域,且al位点与标记C10紧密连锁。al突变的定位区间内共有17个预测基因,对这些预测基因进行信息分析表明,仅BGIBMGA003643基因的功能与黑色素代谢相关。已有研究表明,该基因编码的PTPS酶主要参与四氢叶酸(BH4)的合成,而四氢叶酸又是黑色素代谢的关键酶基因(PAH和TH基因)所必须的辅酶,因此四氢叶酸以辅酶的形式参与黑色索的形成；一旦该基因出现问题将阻碍四氢叶酸的合成,从而黑色素代谢途径受阻,可能会出现缺乏黑色素的相应表型,这与al突变的淡体色表型特征相吻合。且连锁分析发现,该基因与al突变位点紧密连锁。因此,我们将BGIBMGA003643基因作为al突变的候选基因,命名为BmPTPS基因。2. al突变候选基因的克隆及表达模式分析我们分别克隆了al突变和野生型大造中BmPTPS基因的全长cDNA和基因组序列,并详细比较了该基因序列的差异。结果显示：BmPTPS基因在大造和al突变中的基因组大小分别为1893bp和1881bp；该基因上游序列在al突变中存在两处缺失,大小分别为1192bp和314bp,且都是重复序列；BmPTPS基因在野生型大造和al突变中的cDNA全长分别为1014bp和1002bp。与大造相比,al突变在第二外显子上有1lbp(另lbp的缺失在5’UTR内)的缺失,而这1lbp的缺失造成了移码突变并形成了提前终止密码子TAA,导致了BmPTPS基因不能正常翻译成蛋白,功能上存在潜在的缺陷。时期和组织表达显示,BmPTPS基因在大造幼虫各个时期(从蚁蚕到五龄7天)和五龄3天各组织中都有表达。其中,BmPTPS基因在一龄食桑、二龄起、二龄眠、五龄1天以及五龄2天有高量表达,其余各时期的表达量较低；BmPTPS基因在头、血液、马氏管、神经、生殖腺和整个丝腺中均有高量表达。整个时空表达模式分析表明,家蚕BmPTPS基因在一龄到二龄的各时期的表达量变化最为显著,这与al突变出现表型的时期相吻合。同时,我们也通过qRT-PCR检测了BmPTPS基因的mRNA表达水平,结果显示,在al突变中BmPTPS基因的表达量显著下调,仅为大造中的1/4。这些结果进-步表明：BGIBMGA003643基因是al突变的候选基因。3. al突变中四氢叶酸和黑色素代谢路径关键基因的表达及物质含量测定为了验证BmPTPS基因的突变是否会影响四氢叶酸合成途径中其他关键基因的表达,我们详细比较了大造和al突变中四氢叶酸合成途径关键基因的表达差异,定量结果显示,在al突变中,由于BmPTPS基因的突变,导致四氢叶酸合成通路中其他关键基因的表达都发生了相应的变化,即位于该基因上游的GTPCH基因在al突变中明显下调表达,而处于该基因下游的SPR和DHFR基因的表达量是显著上调的。由于四氢叶酸可作为苯丙氨酸羟化酶(PAH)和酪氨酸羟化酶(TH)的辅酶参与黑色素的合成,因此我们详细比较了野生型大造和al突变二龄起蚕中黑色素代谢相关基因的表达及儿茶酚胺类物质多巴和多巴胺的含量差异。结果表明：在al突变中PAH和TH的表达量显著上调,同时这两个酶催化的底物苯丙氨酸和酪氨酸含量也显著高于大造中的含量,分别为大造中的36倍和4倍。而这两个酶催化形成的产物多巴和多巴胺含量在al突变中却是明显下调的,仅为大造中的1/2和1/5。这些结果充分表明了al突变的形成原因：由于BmPTPS基因的突变,导致四氢叶酸合成不足,从而引起黑色素代谢受阻,导致黑色素的缺乏进而产生了al突变的淡体色表型。4.添食抑制剂DAHP后的表型及相关基因的表达从蚁蚕到二龄初期,我们持续向体色正常的家蚕品系N4添食GTPCH(鸟苷酸环化水解酶,BH4合成的限速酶)的抑制剂——2,4-二氨基-6-羟基嘧啶(DAHP),对照组用0.1mol/L NaOH处理。结果表明,添食抑制剂DAHP的实验组,一龄表型正常,第一次蜕皮后全部表现为与白化突变类似的表型,体色变淡,而对照组体色无明显变化,表现为正常的黑色体色。同时我们也检测了四氢叶酸和黑色素合成通路中关键基因的表达情况,发现抑制剂处理后相关基因的表达均与白化突变的趋势一致。荧光定量结果显示,与对照相比,GTPCH和PTPS基因的表达在实验组中显著下调,而SPR和DHFR基因的显著上调表达,黑色素代谢途径中的两个关键基因PAH和TH的表达都显著上调。向出现类似白化表型的实验组重新饲喂BH4,结果表明,抑制剂处理后转而饲喂BH4的蚕体色能够回复为正常表型,而一直饲喂抑制剂DAHP的蚕则保持原来的类似al突变的淡体色不变。证实了抑制剂DAHP是通过抑制四氢叶酸的合成途径从而出现类似al突变表型的,同时也间接证明了al突变表型是由BmPTPS基因的突变引起的。5. BH4回复实验为了进一步证实al突变是由BH4的缺乏引起的,我们设计了BH4的回复实验进行验证。结果表明,添食BH4的al突变个体的体色回复为正常表型,而喂水对照组没有明显变化。BH4处理后的al突变个体中两条通路关键基因的表达均介于野生型大造和al突变之间,逐渐趋于野生型大造。具体来说,与对照组喂水的al突变相比,在BH4处理的al突变中GTPCH和PTPS的表达量有所回升但仍低于大造,而SPR和DHFR基因是显著下调的但仍高于大造中的表达量,同样的,黑色素代谢的两个关键基因PAH和TH在BH4处理的al突变中的表达量也是显著下调的,但仍比大造中的表达量要高。BH4回复实验表明al突变表型是由BH4的缺乏引起的。