基因枪介导抗花叶病和黄叶病RNAi转化甘蔗及分子鉴定研究

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甘蔗是重要的糖料作物和能源作物,但甘蔗花叶病、黄叶病等主要甘蔗病害却制约了甘蔗产业的发展,同时由于甘蔗遗传背景复杂、杂交过程的周期较长以及通过组织培养脱毒存在工作量大和易被病毒再感染等问题,严重制约了通过组织培养获得脱毒甘蔗幼苗和杂交育种获得抗病性的进行,因此利用基因工程技术改良甘蔗抗病虫性状已成为一种有效途径。本研究利用实验室已经构建的具有甘蔗花叶病病毒HC-Pro基因和甘蔗黄叶病病毒CP基因干扰结构的双价干扰表达载体pART27-MC1Y和pART27-MC2Y,具有甘蔗花叶病病毒和黄叶病病毒CP基因干扰结构的pART27-MPY,在验证表达载体的完整性和建立甘蔗品种FN15愈伤组织和分化最适G418筛选浓度的基础上,通过基因枪轰击将三种表达载体分别转入甘蔗品种FN15愈伤组织,而后对遗传转化获得的抗性再生植株进行分子检测,获得了转基因植株。本论文的主要研究成果:1、通过PCR、酶切验证确认实验室保存的RNAi表达载体pART27-MC1 Y、pART27-MC2Y和pART27-MPY完整可用,并通过基因枪转化甘蔗品种FN15愈伤组织。2、通过G418的梯度筛选确立了 FN15在愈伤组织时期的G418筛选浓度为35mg/L,分化苗阶段的筛选浓度为40mg/L。3、通过PCR检测筛选到12株转基因甘蔗植株,通过实时荧光定量PCR检测确定了 5株转甘蔗花叶病病毒和黄叶病病毒CP基因RNAi双价干扰结构的甘蔗植株的拷贝数,利用半定量和定量PCR的方法来分析转基因甘蔗植株的表达量,显示转基因植株中目的基因发生了表达,同时还利用定量PCR的方法对转基因拷贝数和表达量进行了分析,显示转基因甘蔗植株的拷贝数在3.15-5.93个拷贝之间,相对表达量并未与之形成明显的对应关系。
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