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背景与目的宫颈癌(cervical cancer)是发生在宫颈鳞状上皮细胞和宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。随着对女性健康关注的日益增加,宫颈癌被认为是导致女性死亡的第二大恶性肿瘤,发病率逐年增高,目前仅次于乳腺癌,是女性常见的重大疾病之一。越来越多的报道指出,机体的炎症感染是导致肿瘤发生发展的首要因素。但并不是所有的炎症都能发展成为肿瘤。这与机体的免疫调节以及宫颈的微环境变化有着密切的关系。有流行病学调查结果指出：90%以上的宫颈癌患者均伴有人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染,也就是说HPV病毒能够持续作用于宫颈上皮细胞,同时破坏宫颈上皮细胞适应的宫颈微环境,并诱导机体免疫应答平衡失调。另有报道指出：在世界不同地区,宫颈癌合并高危型HPV感染率为86%-94%,其中以16、18型感染最为常见。越来越多的证据表明,高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发病有着密切的关系。免疫功能是机体识别和排除抗原性异物,维持机体生理平衡的重要机制,与肿瘤的发生发展密切相关。宫颈癌患者在慢性炎症的刺激下导致机体的免疫调节及宫颈微环境发生变化。这一系列的变化是如何形成的?机体在面对炎症刺激如何清除病毒感染?肿瘤细胞在形成的过程中如何逃避机体免疫系统的监视?近年来这些问题越来越受到人们的重视。随着研究深入,发现机体的免疫调节系统对肿瘤细胞的发生发展有着至关重要的作用。宫颈癌的发生、发展与肿瘤微环境中局部浸润淋巴细胞的组成和数量的变化密切相关,大量研究表明肿瘤内或癌灶周围的淋巴细胞浸润程度与患者的预后有关。淋巴细胞是肿瘤免疫功能执行的主角,肿瘤组织中的淋巴细胞浸润程度可以作为判断肿瘤预后的一项指标。肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)是一类肿瘤浸润性且具有抗原效应的细胞群,它是一种新型的具有肿瘤杀伤作用的效应性T细胞,具有高效、特异、副作用小等特点,由Rosenberg等于1986年从荷瘤小鼠肿瘤组织中发现并分离。TIL以T细胞为主,同时包含B细胞和NK细胞,表型上主要是CD4~+、CD8~+T细胞。CD4~+T淋巴细胞主要通过识别肿瘤细胞分泌的可溶性抗原,发现肿瘤细胞,并参与多种免疫细胞(如B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、和细胞毒T细胞等)的激活,这些细胞共同发挥抗肿瘤作用。同时,CD4~+T淋巴细胞还能释放多种细胞因子参与机体的抗肿瘤免疫应答。CD8~+T细胞中的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell, CTL)除了能够对靶细胞进行清除以外,还能识别并杀伤被特定病毒感染的细胞及肿瘤细胞。故CD8~+T细胞的数量决定其杀伤靶细胞的效率。TIL中CD4~+CD25~+T细胞是一种起免疫抑制作用的调节性T细胞(regulatory T cell, Treg),而叉状头／翅膀状螺旋转录因子(Forkhead/winged helix transcription factor, Foxp3)是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一。Foxp3~+T淋巴细胞能通过基因转录水平降低促炎因子的表达,并升高免疫抑制因子的表达,从而达到免疫抑制功能。近年来人们对CD4~+、CD8~+及Foxp3~+T淋巴细胞在肿瘤细胞免疫中的作用给予了很大的关注。研究CD4~+、CD8~+及Foxp3~+T淋巴细胞在宫颈癌微环境中的浸润情况对了解宫颈癌局部微环境的变化及宫颈癌的诊治和预后有重要的临床意义。本研究应用免疫免疫组织化学的方法分别检测CD4、CD8及Foxp3在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达情况及三者间的关系,进一步探讨宫颈微环境中CD4~+、CD8~+及Foxp3~+T淋巴细胞浸润情况,为临床治疗宫颈癌及评估其预后提供依据。方法1.临床病理资料收集2012年7月至2014年7月郑州大学第一附属医院妇科进行手术切除或活检的宫颈组织石蜡标本共75例,其中正常宫颈组织12例,宫颈癌63例。宫颈癌组依据2009年国际妇产科联盟(international federation of gynecology and obstetrics, FIGO)的临床分期标准：宫颈癌Ⅰ期21例；Ⅱ期17例；Ⅲ期20例；Ⅳ期5例。2.免疫组织化学蜡块行4Gm厚连续切片,按常规方法脱蜡水化并微波修复抗原,采用免疫组化SP法检测,按试剂说明书进行操作,一抗为鼠单克隆抗体Foxp3(工作浓度为1：100),兔单克隆抗体CD8(工作浓度为1：500),兔单克隆抗体CD4(工作浓度为1：250),室温孵育切片过夜,生物素化兔／鼠通用型IgG(1：200)室温孵育60min；以DAB显色,苏木素轻度复染。用PBS液代替第一抗体设为阴性对照,选用已证实为CD4、CD8、Foxp3阳性切片为阳性对照。3.统计学处理应用SPSS17.0进行统计学分析。两个样本均数的比较采用两样t检验,多样本均数的比较采用单因素方差分析；多个样本率的比较采用(行×列)表Z检验。各检验方法均以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.阳性着色为棕黄色颗粒,CD4、CD8位于T淋巴细胞膜或细胞浆,Foxp3阳性染色主要位于T淋巴细胞核内,少数在细胞膜中显色。CD4在宫颈癌组织中的阳性表达率(46%)明显低于正常宫颈组织中的阳性表达率(100%),差异具有统计学意义(P<0.05)。CD8在宫颈癌组织中的阳性表达率(36.5%)明显低于正常宫颈组织中的阳性表达率(100%),差异具有统计学意义(P<0.05)。Foxp3宫颈癌组织中的阳性表达率(77.8%)明显高于正常宫颈组织中的阳性表达率(8.33%),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.宫颈癌组织中CD4、CD8的表达均与Foxp3的表达呈负相关(r1=-0.470,r2=-0.538,P均<0.05),CD4和CD8的表达呈正相关(r=-0.538,P<0.05)。3.CD4、CD8及Foxp3在宫颈癌组织中的表达与患者年龄、病灶大小及HPV感染型别无关(P>0.05),与FIGO分期、组织学分级相关。与早期(Ⅰ、ⅡI期)宫颈癌组织相比,中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)宫颈癌组织中CD4、CD8阳性表达率较低(P均<0.05),Foxp3阳性表达率较高(P<0.05)。与组织分化程度低(G1-G2)的宫颈癌组织相比,组织分化程度较高(G3)的宫颈癌组织中CD4、CD8阳性表达率较高(JP均<0.05),Foxp3阳性表达率较低(P<0.05)。结论1.宫颈微环境中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞减少或缺失削弱了机体对宫颈癌细胞的免疫抑制,参与了宫颈癌的发展过程。2.宫颈微环境中Foxp3~+T淋巴细胞增加强化了宫颈癌细胞免疫耐受,参与了宫颈癌的发展过程。3.在宫颈微环境中,CD4~+T细胞和CD8~+T细胞均与Foxp3~+T淋巴细胞发挥拮抗作用。