研究背景干细胞因其拥有自我更新、多向分化的特性,而成为组织再生和器官修复的重要细胞来源。毛囊呈周期性的生长、退化和休止,是研究干细胞生物特性的主要模型之一。有两群干细胞—毛囊干细胞和黑素干细胞定居在毛囊隆突部(bulge)-次级毛芽部位。黑素干细胞又因为具有以下特点:黑素干细胞散在分布在毛囊干细胞间,以单细胞为单位行使其功能,分化后易于观察,与其他干细胞所处的微环境相比最简单,因而是一个很好的干细胞模型。在胚胎发育过程中,神经脊产生的黑素母细胞随发育迁入真皮,经表皮迁移至新生毛囊内,定居在毛囊bulge后形成DCT(Tyrosinase)阳性的黑素干细胞,继续向下迁移至毛母质,在此分化成成熟的黑素细胞,它们表达DCT、TYR、TRP1和MITF,催化黑素颗粒的形成。黑素干细胞伴随着毛囊周期性的生长而活化。在生长期,DP(dermal papilla,毛乳头)信号协同激活毛囊干细胞和黑素干细胞,促进着色毛发的生长。在退化期,毛球部、内根鞘和外根鞘细胞大量凋亡,只有少数细胞能回到干细胞巢,恢复静息状态,等待DP信号的再次唤醒。黑素干细胞功能性缺失与毛发色素性缺失性疾病(如灰发症)相关。因此,研究黑素干细胞的功能性再生对毛发色素性缺失性疾病的治疗具有重要的科学意义。TGF-β(Transformation growth factor)、Wnt、Notch、NFIB等多条信号参与调控黑素干细胞。其中Wnt/β-catenin信号在黑素干细胞发育、启动黑素干细胞增殖和分化过程中发挥着重要作用。阻断Wnt1,Wnt3a或β-catenin的表达能抑制神经脊产生黑素细胞;而过表达Wnt1或β-catenin显著增强了黑素细胞的增殖和分化能力。研究还发现Wnt/β-catenin信号能协同激活毛囊干细胞和黑素干细胞。着色毛发的再生依赖于毛囊内的两群干细胞的协同活化。最近已有研究不表明在小鼠背部皮肤中外源性的表达Wnt3a或者Wnt10b能诱导毛囊的黑素生成,然而如何有效的操控Wnt/β-catenin信号来协同活化这两群干细胞同步参与着色毛发的再生值得进一步研究?黑素细胞在鼠和人皮肤中的分布存在差异,只存在于成年小鼠的毛囊中,但在人的表皮、毛囊内都能存活。而人表皮中的黑素细胞缺失或者功能性的缺失与色素缺失性疾病密切相关,如白癜风。研究发现,利用紫外线(Ultra Violet,UV)照射白癜风病人色素缺失区域后,在毛囊周围可以观测到色素斑;用中草药处理白癜风病变区域后,也能在的毛囊周围观测到色素斑。这就提示毛囊黑素干细胞可能参与了表皮的再着色。最近发现UV照射或者创伤能诱导黑素干细胞参与表皮的再次着色,但是黑素干细胞参与表皮的再着色过程中的具体细节以及分子机制的研究并不清楚。SCF、b FGF等信号是维持黑素细胞在表皮内生存的重要信号。SCF/c-kit信号在黑素谱系细胞发育的过程中尤为关键。在黑素细胞的发育早期,SCF或c-kit受体功能性的缺失阻断了黑素母细胞的迁移并促进了黑素母细胞的凋亡;裸突变SCF或c-kit,或者在皮内注射抗c-kit的中性抗体后导致毛发着色缺陷;体外实验证明SCF能显著增加人黑素细胞的迁移和增殖。这些结果表明SCF/c-kit信号参与调控黑素细胞的迁移、生存和分化。而在K14阳性的角质形成细胞内条件性的表达SCF后,黑素细胞能在表皮中生存,那么这些表皮内的黑素细胞是发育早期从真皮迁移来的黑素细胞,还是受到SCF信号的刺激从毛囊迁移来的黑素干细胞?目前,并没有研究表明SCF/c-kit信号能诱导黑素干细胞参与表皮着色。TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯),是一种使用最广泛的佛波酯,最开始是从东南亚的灌木-巴豆中提取出的一种天然小分子。由于TPA与DAG(diacylglycerol,二酰甘油)的形态相似,目前常将TPA作为PKC(protein kinase C,蛋白激酶C)激活剂。TPA通过影响PKC、内皮素、MAPK(mitogen-activated protein kinase)等信号来调控细胞增殖、分化。TPA可用于骨髓性白血病的治疗以及人和鼠的原代黑素细胞培养。TPA能促进神经脊细胞向成熟黑素细胞分化、促进黑素细胞的成熟并生产黑素颗粒。TPA能逆转TGF-β信号对人黑素细胞的生长抑制,这是通过抑制该信号的关键因子—Smad的活性来实现的。此外,TPA还能活化毛囊干细胞进而诱导毛囊的再生。然而,目前没有有关TPA控制的信号在黑素干细胞增殖、分化、迁移等过程中发挥作用的相关报道,也没有探究TPA是否能用于诱导黑素干细胞参与表皮黑素细胞或毛囊黑素细胞的再生的研究。位于bulge-次级毛芽的黑素干细胞与毛囊干细胞共享同一微环境,在毛囊生长早期,接受DP(dermal papilla,毛乳头)信号的刺激后协同增殖、并沿着外根鞘向下迁移至毛母质发生分化,最后形成着色毛发。在TPA或者创伤等特定环境的刺激下,毛囊干细胞向表皮迁移。此外,持续的TPA处理还能激活毛囊干细胞并诱导它们向下迁移,为再生的毛囊提供细胞来源。那么,TPA能否诱导黑素干细胞迁往表皮和毛囊?研究发现TPA能诱导鸟胚胎周围神经元表达c-kit,进而促进黑素细胞的形成。由于神经元和黑素细胞都起源于神经脊,而且SCF/c-kit信号在黑素细胞的增殖、迁移和分化过程中都发挥着重要作用,那么SCF/c-kit信号是否在TPA诱导的黑素干细胞迁往表皮参与表皮的再次着色过程中发挥着重要作用?此外,TPA在处理下丘脑神经元和骨母细胞后能显著的促进β-catenin的表达,有研究也发现TPA通过活化Wnt/β-catenin信号诱导毛囊的再生,那么TPA是否也能活化通过上调Wnt/β-catenin信号协同活化黑素干细胞和毛囊干细胞参与再生毛囊的着色?目的1.探讨TPA能否活化毛囊bulge-次级毛芽处的黑素干细胞参与表皮再次着色、再生毛囊的着色,为临床上治疗皮肤和毛囊色素缺失性疾病提供新的重要参考依据;2.探讨TPA能否通过调控SCF/c-kit信号诱导黑素干细胞向表皮迁移并参与表皮的再次着色;3.探讨TPA能否通过Wnt/β-catenin信号活化黑素干细胞,并诱导它们参与毛发着色。材料方法1.将TPA或者丙酮涂抹在7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮肤上,利用H&E、Masson Fontana染色检测表皮的着色情况,利用L-DOPA法检测催化TYR(黑素合成的关键酶)在皮肤内的活性;利用免疫荧光检测表皮和毛囊中DCT、TYR以及MITF的表达;利用免疫荧光双标技术标记DCT与PCNA来检测黑素干细胞和黑素祖细胞的增殖情况;利用免疫荧光双标技术标记DCT与MITF并结合皮肤的着色情况来分析TPA处理后黑素谱系细胞在毛囊和表皮中分布的差异情况。2.利用创伤愈合实验、Transwell实验检测不同浓度的TPA对黑素母细胞系i MC23细胞迁移的影响;利用TPA处理的皮肤角质形成细胞JB6 cl 30-7b,并用Transwell技术检测处理过的JB6 cl 30-7b能否增强i MC23的迁移;用Na OH法检测不同浓度的TPA对i MC23细胞黑素生成的影响,用L-DOPA法检测TPA处理的i MC23细胞内TYR活性的变化,并利用western blot和免疫荧光检测控制黑素生成的关键酶—DCT、TRP1、TYR的表达。3.利用免疫荧光分别检测SCF和c-kit在TPA或丙酮处理的小鼠背部皮肤中的表达,利用q RT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)检测TPA处理的皮肤以及JB6 cl 30-7b细胞中SCF m RNA的表达,利用western blot检测c-kit在TPA处理的i MC23细胞中的表达;4.皮内注射抗c-kit抗体(ACK2)阻断SCF/c-kit信号后,利用H&E染色、Masson Fontana染色检测ACK2对TPA诱导的表皮着色的影响,利用L-DOPA法进一步检测处理后的皮肤内TYR活性的变化,再利用免疫荧光检测黑素细胞标记物DCT、TYR、MITF的表达;5.利用ACK2抑制SCF/c-kit信号后,采用Transwell技术检测TPA处理的JB6 cl30-7b细胞对i MC23细胞迁移的诱导能力是否会发生变化。6.将TPA或者丙酮涂抹在7周大小的C57BL/6雌性小鼠背部皮肤上诱导毛囊再生成,利用H&E染色、Masson Fontana染色检测TPA诱导的毛囊、丙酮处理的毛囊以及正常生长期VI期的毛囊之间着色的差异,利用免疫荧光技术检测黑素细胞标记物DCT、TRP1、TYR、MITF在各组之间的表达差异。7.用免疫荧光检测各组毛囊中DCT和Brd U(5-bromo-2-deoxyuridine,5-溴脱氧尿嘧啶核苷)的共表达,用来反映黑素干细胞、祖细胞的增殖情况;利用免疫荧光标记MITF和Brd U,用于检测黑素祖细胞在各组毛囊中的增殖情况。8.用免疫荧光检测Wnt/β-catenin信号关键分子β-catenin在各组毛囊内的黑素谱系细胞中的表达情况,旨在检测Wnt/β-catenin信号在各组毛囊中的活化情况。9.在TPA处理的背部皮肤内注射Dickkopf1(DKK1)或N1质粒,利用免疫荧光检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,再用免疫荧光检测核β-catenin在各组毛囊中的表达以验证DKK1对TPA活化的Wnt/β-catenin信号的抑制情况;利用H&E染色和Masson Fontana染色对比DKK1+TPA处理的毛囊、N1+TPA处理的毛囊以及生长期VI期毛囊的着色情况;利用免疫荧光对比黑素细胞标记物在各组毛囊中的表达情况。10.利用免疫荧光标记DCT和Brd U、标记MITF和Brd U在各组毛囊中的分布情况,反映DKK1对TPA活化的黑素干细胞、黑素祖细胞的影响。结果1.TPA处理显著增加了表皮的厚度,处理2次后伴随着皮肤内TYR活性增加,表皮着色开始增加;免疫荧光的结果显示在TPA处理2次后DCT、TYR和MITF表达在毛囊漏斗部和表皮中,而在TPA处理1次后DCT就在毛囊bulge-次级毛芽处增加;在TPA处理1次(包括2次、4次)后毛囊bulge-次级毛芽处的DCT阳性的黑素干细胞表达PCNA;不产黑素颗粒的DCT+MITF-的黑素干细胞出现在毛囊漏斗部而产黑素颗粒的成熟黑素细胞出现在表皮。这些结果说明黑素干细胞能直接迁出毛囊bulge-次级毛芽并在迁往表皮的过程中开始分化、生产黑素颗粒。2.TPA能显著的增强i MC23细胞的迁移;TPA处理的JB6 cl30-7b细胞也能显著的增加i MC23细胞的迁移;TPA以浓度依赖性促进i MC23细胞内黑素颗粒的生成,以浓度依赖性和时间依赖性增强i MC23细胞内TYR活性;TPA处理显著的增加了i MC23细胞内DCT、TRP1和TYR的表达。3.TPA处理1次显著促进表皮角质形成细胞表达SCF,但是没有诱导c-kit的表达,在TPA处理2次后c-kit才在表皮和毛囊漏斗部表达;TPA处理能显著增加皮肤中SCF m RNA的表达以及JB6 cl 30-7b细胞中SCF m RNA的表达;TPA处理i MC23细胞3 h后c-kit的表达显著增加。4.ACK2处理后,TPA诱导的表皮再次着色以及TPA增加的TYR活性都被显著抑制,但TPA增加的表皮厚度没有受到影响;同时,DCT、TYR和MITF在TPA处理的毛囊漏斗部和表皮内的表达被显著抑制。这些结果提示,抑制SCF/c-kit信号阻止了毛囊黑素细胞向表皮迁移、减少了表皮的再次着色。5.Transwell结果显示,ACK2处理后TPA诱导i MC23细胞迁移的作用被抑制,经TPA处理的JB6 cl 30-7b细胞对i MC23细胞迁移的诱导能力也被显著抑制,该结果验证了角质形成细胞来源的SCF/c-kit信号能显著诱导黑素母细胞的迁移。6.TPA处理小鼠背部皮肤4周后能显著的诱导分化正常的毛囊再生,该毛囊的毛干、毛球部尺寸较正常生长期VI期毛囊的更大,毛母质的着色更明显,毛球部内表达DCT、TRP1、TYR和MITF更多。7.DCT和Brd U双阳性细胞在TPA处理的毛囊bulge、毛母质处显著增加,MITF和Brd U双阳性细胞在TPA处理的毛球部显著增加,提示TPA显著促进了毛囊内黑素干细胞、黑素祖细胞的增殖。8.在TPA处理的毛囊内表达核β-catenin的黑素细胞数明显增加,提示TPA显著增加了Wnt/β-catenin信号在黑素细胞内的活性。9.在TPA处理并注射质粒的皮肤内,GFP明显表达在毛囊、真皮和皮下组织中;DKK1显著的抑制了TPA诱导的表达核β-catenin的黑素细胞数,表明DKK1转染成功后抑制了TPA诱导的Wnt/β-catenin信号。此外,DKK1控制了TPA对毛球部、毛干大小、毛母质着色的作用,抑制了DCT、TRP1、TYR和MITF在TPA处理的毛球部的表达,表明抑制Wnt/β-catenin信号后毛球部、毛干大小以及毛母质着色恢复到相对正常的水平。10.免疫荧光显示DKK1显著抑制了TPA增加的bulge和毛球部中DCT和Brd U双阳性细胞数目,以及毛球部的MITF和Brd U双阳性细胞数目,提示抑制Wnt/β-catenin信号能显著抑制TPA促进黑素干细胞和黑素祖细胞增殖的作用。结论1.TPA促进黑素干细胞增殖、直接迁出干细胞巢、前往表皮参与表皮的再次着色,SCF/c-kit信号是TPA诱导的黑素干细胞迁移至表皮并参与其再次着色所必须的信号,这为临床上治疗皮肤色素性缺失性疾病提供重要的实验参考依据;2.持续的TPA处理能活化黑素干细胞参与再生毛囊的着色,Wnt/β-catenin是调控TPA诱导的毛囊着色的关键信号,这为临床上治疗毛发色素缺失性疾病提供重要的理论参考。