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目的: 构建具有光动力治疗功能的金纳米探针,进一步结合细胞因子诱导的杀伤性细胞(Cytokine induced killer cells,CIK cells),为肺癌的诊断治疗一体化提供研究基础。金纳米星(Gold nanostars,GNS)用巯基化的聚乙二醇(Sulfhydryl polyethylene glycol, SH-PEG-NH2)稳定后,负载上光敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6, Ce6 ),形成了具有光动力治疗效果的、生物相容性好的金纳米探针GNS-PEG@Ce6。脐带血中分离出单个核细胞(Mononuclear cells,MC),诱导成CIK细胞。随后对培养14 d的CIK细胞进行CD3+CD56+表型分析。探针GNS-PEG@Ce6与CIK细胞共孵育后形成细胞探针NP-CIK(其中NP-CIK为吞噬了GNS-PEG@Ce6的CIK细胞)。探讨两种探针对肺癌A549细胞的杀伤作用。 方法: 1. GNS-PEG@Ce6的合成与表征 GNS用SH-PEG-NH2修饰后,与Ce6孵育,形成探针GNS-PEG@Ce6。表征探针及测定探针的浓度(其中探针浓度由负载的Ce6的量表示)。 2. 探针细胞安全性分析 对比探针GNS-PEG@Ce6与Ce6对肺癌A549细胞的细胞毒性。 3. 细胞吞噬探针的检测 当A549细胞与5μg/mL的探针或Ce6共孵育时,比较细胞吞噬探针与Ce6的情况。 4. 探针细胞水平的治疗作用 在氦氖近红外光照射(He-Ne NIRlaser)后,比较探针与Ce6对A549细胞的光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)作用。 5. 脐带血中分离MC 用6%羟乙基淀粉(Hydroxyethyl starch, HES)沉淀脐带血中的红细胞后,用人淋巴细胞分离液分离沉降过的脐带血得到MC。 6. CIK细胞的诱导、扩增培养及表型分析 用干扰素γ(Interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)和CD3单克隆抗体(CD3 monoclonal antibody,CD3 mAb)将MC诱导成CIK细胞,扩增培养至14 d后进行CD3+CD56+表型分析。 7. CIK细胞的细胞学应用 当CIK细胞与5μg/mL的探针或Ce6共孵育时,观察两者进入细胞的区别。并且观察细胞探针NP-CIK对A549细胞的协同杀伤作用。 结果: 1. 探针GNS-PEG@Ce6为棱角分明的星型结构,粒径在70 nm左右。探针在相应波长处有与Ce6和GNS相同的特征吸收峰。 2. 当浓度相同的Ce6或探针与A549细胞共孵育时,Ce6组的细胞存活率稍高于与GNS-PEG@Ce6组,并且两组的细胞存活率均随着材料浓度的增高而下降。 3. 当A549细胞与5μg/mL的Ce6或探针共孵育时,两组红色荧光均随着孵育时间的延长而增强,并且相同时间内GNS-PEG@Ce6组的红色荧光强于Ce6组。 4. 在He-Ne 激光照射下,GNS-PEG@Ce6组的细胞存活率明显低于相同浓度的Ce6组。两组的细胞存活率均随着材料浓度的增高而下降。A549细胞与5 μg/mL的Ce6或探针共孵育后,在He-Ne NIR照射下,细胞存活率明显低于未与材料共孵育组。 5. 脐带血用HES沉淀后,用密度梯度离心法分离可以得到MC。 6. 诱导形成的 CIK 细胞中 CD3+T淋巴细胞、CD56+T淋巴细胞、CD3+CD56+T淋巴细胞的比例分别为86.2%、34.6%、21.4%。 7. CIK细胞与5 μg/mL 的探针或Ce6共孵育时,随着时间的延长,两组红色荧光均增强,并且相同时间内 GNS-PEG@Ce6 组的荧光强于 Ce6 组。A549+CIK组、A549+Ce6-CIK 组、A549+NP-CIK 组、A549+CIK+laser 组的细胞存活率均在87%左右,而A549+NP-CIK+laser组的细胞存活率仅为60%左右。 结论: 1. 探针GNS-PEG@Ce6粒径均一,分散性良好,稳定性高。探针确实是由GNS、SH-PEG-NH2、Ce6构成。 2. 探针对A549细胞的细胞毒性稍高于Ce6,但毒性仍在可应用的范围。 3. 相较于Ce6,A549细胞能更高效地吞噬探针,从而使其发挥更好的PDT作用。 4.在He-Ne NIR照射下,探针较Ce6对A549细胞具有更好的PDT作用。 5. 脐带血中成功分离得到MC。 6. 诱导形成的CIK细胞具有强大的杀瘤活性。 7. 探针较Ce6,能更有效地进入CIK细胞。细胞探针对A549细胞具有协同杀伤作用。