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家族性高胆固醇血症(FH)是一种严重的单基因显性遗传性疾病,其主要临床表现为血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平显著升高,皮肤肌腱多部位黄色瘤和早发冠心病。临床分为纯合子(重症)和杂合子(轻症)两种类型:纯合子患者罕见发病率为1/百万,但病情严重,青少年时期就出现严重的动脉粥样硬化(As)甚至心肌梗死而死亡,给家庭和社会带来沉重负担;杂合子患者发病率为1/500,症状虽不及纯合子严重但其As进展仍然加速。由于FH是As最危险因素而受到世界各国的重视。目前认为,FH的病理基础是基因突变导致体内胆固醇代谢异常。虽然已经发现6种致病基因,包括低密度脂蛋白受体(LDLR)、载脂蛋白B100(ApoB100)、枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)等,但LDLR是最主要的致病基因。因此,筛查FH患者及其家系LDLR基因突变对于早期诊断、遗传咨询、产前基因诊断及日后基因治疗至关重要。由于FH纯合子患者症状严重且无法治愈,产前基因诊断尽早发现纯合子胎儿是最有效预防措施,可避免FH纯合子患儿的出生,减轻家庭和社会负担,对于优生优育提高人口素质,避免重症患儿出生有重要意义。本研究将基础研究成果转化为临床应用,为转化医学研究提供思路。
[目的]
通过收集5个生育过重症FH患儿并有再次妊娠愿望的妇女及其核心家系,在排除其他致病基因突变后着重筛查LDLR基因突变,并采用生物信息学方法对检测到的新突变位点进行蛋白结构改变预测,初步阐明该突变位点的致病机制。进而分别对再次妊娠的妇女在孕早期取羊水脱落细胞提取胎儿DNA,检测该家系内LDLR基因存在突变的位点,并与家系先证者及其父母比对,明确胎儿携带致病突变位点及数目,推断是否为重症患儿,完成超早期诊断。
[方法]
1、根据陈在嘉主编《临床冠心病学》中制定的FH临床诊断标准,选取5个生育过临床确诊FH纯合子患儿并有再次妊娠愿望的妇女及其核心家系,进行问卷调查,记录临床症状、体征等一般临床资料,对患者进行心电图、超声心动和心肌核素显像等影像学辅助检查。
2、取患者空腹抗凝血,血浆用于脂蛋白检测及肝肾功能检测,血细胞用于提取基因组DNA。
3、PCR扩增ApoB100基因后测序,排除ApoB100 Q3500位点附近的突变。
4、采用降落PCR方法对LDLR启动子及全部18个外显子跨越部分内含子进行扩增,测序后筛查突变位点。
5、对筛查到的新突变将核酸序列转换为氨基酸序列,以氨基酸序列为模板,使用SWISS-MODEL服务器预测突变LDLR蛋白的三级结构及突变位点附近氨基酸原子非局部环境能量并与野生型比较,推测新突变位点的致病性。
6、对再次妊娠的家系妇女,于孕16～20周时在超声引导下行羊膜腔穿刺术抽取羊水,提取胎儿脱落细胞DNA。
7、分别检测胎儿相应家系LDLR基因突变,并与该家系成员比对,判断胎儿是否为重症。
[结果]
1、入选的5个家系第一胎患儿(先证者)均符合FH纯合子的临床诊断,皮肤多部位黄色瘤,血清胆固醇水平大幅增高(9.90～24.65 mmol/L),家系夫妇双方都符合FH杂合子的临床诊断。
2、入选的5个家系均未检测出ApoB100核苷酸序列Q3500R、R3531C和R3500W位点突变;
3、核苷酸序列分析发现5例纯合子患儿LDLR基因均为复合杂合突变(C122Y/L561F;C201F/1358+32C＞T;Y398X/A606T;I402T/C356G;H562Y/P664L),且分别来自其父母的遗传,其中C201F(G＞T at665),C356G(T＞G at1129),Y398X(C＞A at1257)为新突变。
4、生物信息学发现C201F和Y398X突变的LDLR蛋白的三级结构与正常明显不同,C201F突变蛋白配体结合域末端较正常蛋白缺失一个α螺旋,蛋白结构发生明显改变,同时由于氨基酸是极性变化导致LDLR蛋白的疏水性发生变化,预测突变蛋白结合LDL的能力大大降低。突变Y398X的LDLR蛋白缺失两个β折叠,EGF前体结构域较正常缩短;原子非局部环境评估发现C201F突变、C356G突变以及Y398X突变后,该位点附近氨基酸原子非局部环境能量增高,稳定性下降。
5、入选的5个家系妇女已经有4个成功再次妊娠,于孕16～20周时在超声引导下行羊膜腔穿刺术成功抽取羊水,并提取胎儿脱落细胞。DNA。
6、胎儿LDLR基因检测并与家系成员比对证实,1例不携带其家系内任何突变,2例携带所在家系中的1个突变,1例携带其家系内的2个突变。
[结论]
1、入选5个家系均符合FH的临床诊断,其中5个患儿为FH纯合子,父母为FH杂合子。
2、5个家系分别检测到10种互不相同LDLR基因突变,其中G＞T665,T＞G1129,C＞A1257国内外未见报道,可能是新突变。
3、新突变位点导致的LDLR蛋白三级结构不规律改变及原子非局部环境变化可能是导致FH患者LDLR功能缺失的病理机制。
4、胎儿产前基因诊断结果推断:1例为正常个体,2例为FH杂合子,1例为FH重症患儿。
综上所述,本文通过收集5个重症FH家系重点检测LDLR基因突变,并采用生物信息学方法对3个新突变位点进行蛋白结构改变的预测,初步阐明该突变的致病机制。进而获取4例再次妊娠妇女羊水脱落细胞的胎儿DNA,检测该家系内LDLR基因存在突变的位点,推断是否为重症患儿,实现超早期诊断。