论文部分内容阅读
背景：胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤,尽管目前在外科切除,放化疗及其他生物学治疗上取得了一些进展,但其预后仍然很差。所以,深入研究其发生发展的细胞及分子机制具有重大现实意义。SWI/SNF (mating-type switching/sucrose non-fermenting,交换型转换/蔗糖不发酵复合物)是一种进化保守的多亚基单位的染色质重塑复合物,它能够利用ATP水解产生的能量动员核小体,使染色质重构,从而调节靶基因的转录。染色质重塑复合物如果发生突变,可导致染色质不能重塑,影响基因的正常表达,导致人类疾病。如果突变引起抑瘤基因异常将导致癌症。ARID1A (AT rich interactive domain1A,AT丰富结合域1A)是目前研究最热门的SWI/SNF亚基单位。位于人染色体的1p36.11域,在肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌等肿瘤中起着抑瘤基因的作用,但它在人脑胶质瘤组织中的表达情况及对胶质瘤的生物学影响目前国内外均无相关报道。目的：探讨ARID1A基因在人脑胶质瘤组织中的表达情况及与病理分级的关系。构建ARID1A真核表达载体,为后续实验提供基础。探讨ARID1A对胶质瘤细胞生长、增殖、侵袭、凋亡等多种生物学特性的影响及其对胶质瘤细胞生长增殖、侵袭的作用机制。方法：收集55例新鲜胶质瘤和5例新鲜脑组织标本,用定量RT-PCR及western blot分别检测胶质瘤和脑组织中ARID1A mRNA与蛋白表达差异,及它们的表达水平与胶质瘤病理分级的关系。将ARID1A克隆入pCDNA3.1(+)-ARID1A真核表达载体酶切及DNA测序鉴定。用Lipofectamin脂质体法将重组pCDNA3.1(+)-ARID1A转染人U87胶质母细胞瘤细胞株,并使用定量RT-PCR及western blot验证效果。分别使用MTT、Transwell侵袭实验、流式细胞仪等多种技术检测ARID1A对U87细胞的生物学影响。使用定量RT-PCR及western blot技术对c-MYC基因、MMP-2、MMP-9及PI3K信号通路的下游蛋白pAKT和pS6K检测,研究这些基因在转录和翻译水平的变化。结果：1、与正常脑组织相比,胶质瘤中ARID1AmRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.01)。低级别胶质瘤表达量高于高级别胶质瘤,且随着胶质瘤病理级别的上升,ARID1A的表达量下降(P<0.05)。ARID1A表达水平与患者年龄、性别不相关(P>0.05)。2、转染ARID1A真核表达质粒后,ARID1A过表达组胶质瘤细胞中该基因的mRNA表达量上调约2.59倍,蛋白表达量上调近3倍,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3、转染ARID1A真核表达质粒48h后,ARID1A过表达组胶质瘤细胞增殖率下降约25%,与U87组及U87-vector组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。G1期、S期和G2期的细胞比例：ARID1A过表达组为：66.31%±1.47%、24.57%±3.15%、9.12%±0.48%；U87-vector组为：40.23%±2.45%、37.51%±3.41%、22.26%±3.26%；U87组为：37.83%±3.34%、38.43%±2.15%、23.74%±2.42%,ARID1A过表达组与其他两组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ARID1A过表达组、U87-vector组、U87组的细胞凋亡率分别为：14.81%,2.33%,0.84%,ARID1A过表达组与另外两组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。ARID1A过表达组、U87-vector组、U87组的细胞侵袭能力(MTT法检测OD值校正后代表侵袭能力)分别为：42.2%±±11.5%,98.6%±4.83%,100%±5.13%,ARID1A过表达组与另外两组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。4、转染ARID1A真核表达质粒48h后,ARID1A过表达组胶质瘤细胞中c-MYC的mRNA及蛋白表达量明显下降,与U87-vector组和U87组相比,差异有统计学意义(P<0.01)o ARID1A过表达组细胞pAKT、pS6K、MMP-2和MMP-9蛋白的表达相比另外两组均下降(P<0.01)。结论：1、ARID1A基因表达在胶质瘤中较正常脑组织中明显下降；ARID1A基因表达与胶质瘤级别(WHO分级)呈负相关。2、ARID1A过表达可抑制胶质瘤细胞的生长增殖、降低胶质瘤细胞的侵袭性、诱导胶质瘤细胞凋亡。3、ARID1A通过抑制c-MYC或PI3K通路抑制胶质瘤细胞的增殖；通过抑制MMP-2、MMP-9来抑制胶质瘤细胞的侵袭。4、ARID1A基因可以作为潜在的胶质瘤诊断和治疗靶点,为胶质瘤的治疗提供新思路。