旋毛虫通过多种复杂的机制来调节宿主免疫反应,创造一个有效的抗炎环境,确保其成功寄生并在宿主体内长期生存。细胞外囊泡(EVs)是一种微小的囊泡状结构,几乎所有类型的细胞均可产生并释放EVs。研究表明,多种寄生虫均可分泌细胞外囊泡,并在寄生虫感染期间介导宿主的免疫反应。本课题目的是利用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠实验性结肠炎模型,研究旋毛虫分泌的EVs对宿主的免疫调节作用,为旋毛虫病的免疫调节机制研究提供新思路。首先,通过超速离心法分离获得旋毛虫肌幼虫期胞外囊泡(Ts-EVs),并通过透射电子显微镜(TEM)、Western Blot、纳米颗粒追踪分析(NTA)技术对分离的Ts-EVs的形态、大小和特异性标记物进行鉴定。结果显示,TEM鉴定可见Ts-EVs呈双分子层囊泡状结构;Western Blot鉴定显示Ts-EVs可与EVs特异性标志物CD63和烯醇化酶发生特异性反应;进一步NTA鉴定显示粒径主峰为133 nm,粒径主要分布在50-250 nm之间,结果表明本研究成功获得旋毛虫肌幼虫期胞外囊泡,且分离的EVs可以用于进一步的功能鉴定。其次,本研究分析了Ts-EVs对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎的干预效果。Ts-EVs的免疫流程为:将获得的EVs腹腔注射于Balb/c小鼠,随后采用直肠给药,建立TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎模型。在建模第3天处死小鼠,通过DAI、宏观评分和微观评分,分析EVs对小鼠结肠炎的干预效果。在宏观上,基于体重、DAI评分、结肠长度、结肠出血充血等指标,发现Ts-EVs可缓解临床症状;进一步基于HE、PAS染色以及MPO活性微观分析表明,Ts-EVs降低结肠组织病理学损伤,如炎性细胞浸润减少,杯状细胞数量增加,同时MPO活性降低。为探讨Ts-EVs对TNBS诱导的小鼠结肠炎肠道屏障的影响,采用免疫荧光法检测结肠组织中紧密连接蛋白Occludin和ZO1的表达情况,结果发现,提前注射Ts-EVs组小鼠结肠组织的Occludin和ZO1表达水平明显高于TNBS组,表明Ts-EVs通过防止肠道屏障的破坏,而对TNBS诱导的结肠炎具有保护作用。综合以上实验结果,Ts-EVs可以干预TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎。最后,本研究通过MSD电化学发光技术及荧光定量PCR对肠道局部炎性因子和转录因子的表达进行检测;进一步通过流式细胞术分析Ts-EVs在结肠炎模型中对T细胞分化的影响。MSD结果发现:TNBS诱导所有炎性细胞因子的释放,而提前注射Ts-EVs显著降低促炎细胞因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IL-17A的表达水平,促进抗炎细胞因子如IL-10、TGF-β、IL-4和IL-13的表达水平;此外,与TNBS组相比,提前注射EVs显著降低趋化因子MIP-3α的水平。荧光定量PCR结果显示,与TNBS组相比,提前注射Ts-EVs显著抑制Th1(IFN-γ、T-bet)和Th17(IL-17A、RORγt)、而促进Th2(IL-4、GATA3)和Treg(IL-10、Foxp3)炎性因子和相关转录因子mRNA的表达。以上结果表明,Ts-EVs可以通过调节结肠炎性因子和转录因子的表达,从而有效干预IBD的发生、发展。进一步细胞因子流式结果表明:与TNBS组相比,提前注射EVs显著降低Th1(CD4~+IFN-γ~+)和Th17细胞(CD4~+IL-17~+)的数量,其中对Th1细胞抑制更明显,而Th2细胞(CD4~+IL-4~+和IL-13~+)数量明显增加;此外,提前注射EVs促进Treg细胞少量增殖。以上结果表明,Ts-EVs改善结肠炎的能力与肠系膜淋巴结中抑制Th1细胞增殖、调节Th17/Treg细胞平衡有关。综合以上实验结果,Ts-EVs具有免疫调节作用,并可以缓解TNBS化学诱导的小鼠实验性结肠炎,为旋毛虫与宿主免疫系统之间相互作用提供实验基础和理论依据。