【摘 要】
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植物次生代谢产物通常是为植物提供防御病虫害的功能物质,但病原真菌在侵染宿主植物的过程中对植物化学防御系统的适应却是造成严重病害的原因之一,而目前这种适应机制的研究报道较少。苹果腐烂病菌（Valsa mali var.mali,Vmm）主要以苹果属植物为宿主,该病原真菌的侵染能够造成苹果树树枝的溃烂和果实的腐烂,严重时甚至能使得果树死亡。为了探究苹果腐烂病菌的毒性物质,揭示苹果腐烂病菌对苹果属植物化
【基金项目】
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辽宁省兴辽英才计划（项目编号:XLYC1907151）； 沈阳农业大学科研基金资助项目（项目编号:880416055）；
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植物次生代谢产物通常是为植物提供防御病虫害的功能物质,但病原真菌在侵染宿主植物的过程中对植物化学防御系统的适应却是造成严重病害的原因之一,而目前这种适应机制的研究报道较少。苹果腐烂病菌（Valsa mali var.mali,Vmm）主要以苹果属植物为宿主,该病原真菌的侵染能够造成苹果树树枝的溃烂和果实的腐烂,严重时甚至能使得果树死亡。为了探究苹果腐烂病菌的毒性物质,揭示苹果腐烂病菌对苹果属植物化学防御系统的适应机制。本论文以苹果腐烂病菌Vmm-30及其宿主植物苹果和野苹果作为研究材料,通过侵染诱导导向化学分离,结合植物化学和波谱结构鉴定手段,以及生物活性筛选方法,研究了苹果腐烂病菌的毒性物质,及其对宿主次生代谢物的利用机制。利用高效液相色谱（HPLC-DAD）对苹果（Malus pumila Mill.）和野苹果（M.sieversii）的根、叶和枝干中的化学物质进行分析,发现根皮苷（Phlorizin,1）是苹果属植物各部位中最主要的次生代谢产物,在野苹果和苹果树枝内的含量高达8.24±0.17-9.46±1.22 mg/g DW,并且根皮苷是苹果属植物的组成型防御物质。为了探究病原真菌侵染后植物的化学响应,对苹果腐烂病菌Vmm-30侵染枝干的化学物质进行了系统的成分分析,发现在Vmm-30菌株侵染后,树枝内根皮苷的含量显著降低。而根皮苷与Vmm-30孢子悬浮液混合培养后,通过HPLC-DAD和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析发现,Vmm-30菌株能够将根皮苷逐级降解为根皮素（Phloretin,2）,间苯三酚（Phloroglucinol,3）,对羟基苯丙酸（3-（4-Hydroxyphenyl）propionic acid,4）,对羟基肉桂酸（4-Hydroxy-cinnamic acid,5）,3-羟基肉桂酸（3-Hydroxycinnamic acid,6）,对羟基苯乙酮（4′-Hydroxyacetophenone,7）,肉桂酸（trans-Cinnamic acid,8）,对羟基苯乙酸（4-Hydroxyphenylacetic acid,9）,对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid,10）和原儿茶酸（3,4-Dihydroxybenzoic acid,11）定量分析发现,下游降解产物在被菌株侵染树枝内的含量增加。本论文利用与Vmm-30无营养孢子悬浮液共培养的技术方法,探究根皮苷及其降解产物对病原菌分生孢子萌发的影响。与对照相比,病原菌孢子的浓度在与根皮苷共培养溶液的120-168 h内出现显著升高。根皮苷降解产物与孢子的共培养中,间苯三酚（Phloroglucinol,3）,对羟基苯丙酸（3-（4-Hydroxyphenyl）propionic acid,4）,对羟基苯乙酸（4-Hydroxyphenylacetic acid,9）,对羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid,10）和原儿茶酸（3,4-Dihydroxybenzoic acid,11）能够促进病原菌孢子浓度的升高,并且在24-36 h就有显著升高,时间明显短于根皮苷共培养处理。显微观察发现,在孢子浓度上升的时间段内观察到病原菌孢子的萌发。本研究表明了根皮苷及其降解产物能够促进苹果腐烂病菌Vmm-30孢子的萌发。进一步对苹果腐烂病菌Vmm-30发酵液中的化学物质进行分离,通过活性筛选发现了具有植物毒活性的物质,其中化合物W-C-3（5-Methylmellein）在50μg/m L的浓度下能够显著抑制红苋菜种子的生长（p＜0.05）;化合物W-C-1（4-Methoxybenzoic acid）在100μg/m L的浓度下能够对苹果叶片造成与苹果腐烂病发病症状一样的红褐色病斑。本研究丰富了Vmm-30的化学多样性,揭示病原菌本身的毒性物质也是成功入侵宿主植物的原因之一。由于苹果腐烂病菌对苹果属植物具有偏好性寄生的特性,本研究首次从宿主植物的化学防御系统出发,发现苹果腐烂病菌入侵宿主的过程是一个多样且复杂的过程。在侵染宿主的过程中,病原菌利用了寄主植物的防御物质,通过降解宿主中的主要次生代谢物质根皮苷,将根皮苷降解为对自己生长有益的物质从而打破植物的一道防御系统;并且利用降解得到的代谢产物促进自身孢子的萌发,从而使得分生孢子能更快定殖在宿主体内大量繁殖,进而加快对宿主的侵染,随后病原菌本身也能产生一些具有毒性的物质,从而造成宿主植物的病变加剧。本论文系统地研究了苹果腐烂病菌Vmm-30对根皮苷的降解产物,明确了Vmm-30菌株对根皮苷的降解途径;首次发现苹果腐烂病菌Vmm-30能够利用宿主植物根皮苷的降解产物促进自身分生孢子的萌发;通过研究苹果腐烂病菌Vmm-30与宿主次生代谢产物之间的关系阐明了病原菌侵染宿主的化学机制,诠释了苹果腐烂病菌如何攻破植物的化学防线,从化学防御物质的角度揭示了苹果腐烂病菌能成功侵染苹果属植物的原因,为苹果腐烂病的发生与防治提供理论基础。
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