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背景和目的:炎症是动脉粥样硬化和2型糖尿病的共同基础。冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型,2型糖尿病是冠心病的等危症。不稳定性斑块是导致急性冠脉综合征(ACS)的病理基础,而炎症在斑块的破裂、血栓形成和局部血管收缩中起极为重要的作用。业已证明ACS合并2型糖尿病时,冠脉病变严重,治疗效果差,预后不良,与不伴有糖尿病的患者有明显的不同,可能与两者并存时炎症加重有关。因此研究炎症及其调控机制在不稳定型心绞痛合并糖尿病中的作用极为重要。大量研究表明先天性免疫系统和后天获得性免疫反应共同参与机体的炎症反应,而其中模式识别受体在介导先天性免疫中起重要作用,可能是联系炎症与动脉粥样硬化的桥梁。Toll样受体(TLRs)是重要的先天免疫模式识别受体,TLR4是TLRs家族中的重要成员,TLR4信号通路的激活介导了众多炎症因子的表达。TLR4在动脉粥样斑块的内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞表达均增高,在急性冠脉综合征患者外周血单核细胞表达增高。另外,TLR4通路激活引起的IKK激活和炎症因子分泌增加介导了胰岛素抵抗的发生,胰岛素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理基础,但对TLR4在2型糖尿病患者中的表达研究较少且结果不一。我们以往的研究发现,在不伴有糖尿病的ACS患者外周血单核细胞中,TLR4存在过度激活,单核细胞和转录因子NF-κB进一步活化,并产生大量的炎症因子。TLR4介导的炎症反应在动脉粥样硬化斑块的形成、发展和破裂中可能具有重要作用。但ACS合并2型糖尿病时炎症反应的加重是否与TLR4过度激活及TLR4信号通路的调控变化有关,尚不清楚。研究表明,各种内、外源性配体可特异性激活细胞膜上的TLR4受体,进一步通过TLR4/NF-κB信号通路参与炎症因子的产生和炎症反应。新近发现锌指蛋白A20通过泛素化和去泛素化调节参与TLR4/NF-κB信号通路的调控,负反馈调节TLR4信号。A20由各种刺激如TNF-α、LPS等诱导产生,是NF-κB活化的产物,同时又可以负反馈抑制NF-κB的激活,是终止TLR4诱导的NF-κB激活和促炎症因子表达所必需的。A20在冠心病、糖尿病以及冠心病合并糖尿病中的表达如何,尚不明确。不稳定斑块中激活的单核巨噬细胞分泌大量的炎症因子导致斑块破裂,斑块中的单核巨噬细胞主要来自血液循环,故循环中的单核细胞可反映斑块中单核细胞状态。本研究通过观察2型糖尿病患者、不稳定型心绞痛患者、不稳定型心绞痛合并2型糖尿病患者外周血单核细胞中TLR4、A20及血浆中炎症因子表达变化,并在离体实验中观察以上患者外周血单核细胞TLR4信号通路激活后A20和炎症因子表达变化,以及转染A20对该通路的作用。同时观察高糖对正常人单核细胞TLR4通路的影响及药物(他汀、厚朴酚)干预作用,探讨不稳定型心绞痛合并2型糖尿病患者炎症反应的发生和调控机制,为其防治提供理论依据。方法和结果:第一部分:实验对象分为四组:对照组(A组)20例,2型糖尿病组(B组)22例,不稳定型心绞痛组(C组)18例,2型糖尿病合并不稳定型心绞痛组(D组)19例。取外周血采用流式细胞仪检测单核细胞TLR4蛋白的表达;分离外周血单核细胞,免疫组化法检测A20蛋白表达,Real time RT-PCR检测TLR4mRNA、A20mRNA表达;分离血浆,采用ELISA法检测血浆中促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10浓度。结果发现2型糖尿病患者、不稳定型心绞痛患者外周血单核细胞TLR4、A20表达,血浆TNF-α浓度及TNF-α/IL-10显著高于对照组(P<0.05)。不稳定型心绞痛合并2型糖尿病患者上述指标高于单纯2型糖尿病患者及单纯不稳定型心绞痛患者(P<0.05)。单核细胞TLR4mRNA和蛋白与FBG、FIN、HOMA-IR、HbA1c、TNF-α、IL-10正相关(P<0.05)。第二部分:(一)实验对象分为四组:对照组(A组)12例,2型糖尿病组(B组)15例,不稳定型心绞痛组(C组)15例,不稳定型心绞痛合并2型糖尿病组(D组)15例。分离外周血单核细胞,分别用LPS或PBS刺激单核细胞,用Real time RT-PCR检测刺激3小时后单核细胞TLR4mRNA、A20mRNA表达,用ELISA法检测刺激24小时后细胞培养物上清液中TNF-α和IL-10浓度。结果发现对照组单核细胞受LPS刺激后TLR4、A20表达明显上调(P<0.05),而不稳定型心绞痛患者、2型糖尿病患者及不稳定型心绞痛合并2型糖尿病患者单核细胞LPS刺激后TLR4、A20表达变化无明显差异。LPS刺激使单核细胞TNF-α、IL-10分泌明显增高,与对照组相比各实验组单核细胞分泌TNF-α更多,IL-10较少,TNF-α/IL-10增高(P<0.05)。(二)分别将2型糖尿病患者、不稳定型心绞痛患者、不稳定型心绞痛合并2型糖尿病患者单核细胞分为空质粒转染及A20转染组,转染48小时后,采用免疫荧光方法检测GFP报告基因,免疫组化检测A20蛋白表达,Real time RT-PCR检测外源性A20mRNA表达。转染48小时后,予LPS刺激2小时,免疫组化检测NF-κBp65蛋白表达,予LPS刺激24小时,ELISA法检测培养上清TNF-α和抗炎因子IL-10浓度。结果发现A20转染能降低各实验组LPS刺激后单核细胞细胞核NF-κBp65表达和细胞培养物上清液中TNF-α浓度,增加培养上清IL-10浓度,使TNF-α/IL-10降低。第三部分:分离正常人单核细胞,用正常糖、高糖单独或联合阿托伐他汀和厚朴酚刺激48小时。用Real time RT-PCR检测单核细胞TLR4mRNA、A20mRNA表达,Western blot检测单核细胞TLR4、A20蛋白表达;用正常糖、高糖单独或联合阿托伐他汀和厚朴酚刺激单核细胞48小时后,再用LPS刺激2小时,用Western blot法检测NF-κBp65蛋白表达,刺激24小时,用ELISA法检测细胞培养物上清液TNF-α和抗炎因子IL-10浓度。结果发现高糖使单核细胞TLR4mRNA及蛋白、A20mRNA及蛋白表达增高,高糖培养的单核细胞与正常糖培养的单核细胞相比,LPS刺激后细胞核NF-κBp65表达明显增强,TNF-α分泌增多,IL-10分泌减少(P<0.05)。阿托伐他汀、厚朴酚可降低高糖所致的TLR4、A20表达上调,降低高糖作用的单核细胞LPS刺激引起的NF-κBp65表达增加和TNF-α分泌增加,上调抗炎症因子IL-10的分泌。结论:(1)不稳定型心绞痛、2型糖尿病存在促炎/抗炎失衡。不稳定型心绞痛合并2型糖尿病这种失衡更明显。(2)单核细胞TLR4信号通路参与了不稳定型心绞痛、2型糖尿病的炎症反应,与不稳定型心绞痛合并糖尿病炎症反应加重有关。(3)不稳定型心绞痛、2型糖尿病、不稳定型心绞痛合并糖尿病时单核细胞TLR4表达上调,A20上调不足与炎症反应有关。(4)增加A20表达可降低不稳定型心绞痛、2型糖尿病、不稳定型心绞痛合并糖尿病单核细胞TLR4通路过度激活所致的炎症反应。(5)高糖可通过增加单核细胞TLR4表达增强TLR4通路介导的炎症反应。(6)他汀类药物可通过降低单核细胞TLR4表达、抑制NF-κB的激活抑制高糖对TLR4信号通路的影响。(7)中药厚朴酚可通过降低单核细胞TLR4表达、抑制NF-κB的激活抑制高糖对TLR4信号通路的影响。