论文部分内容阅读
特异性卵黄抗体,即卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin Yolk, IgY),在防治由细菌或病毒感染引起的动物性疾病方面具有安全无残留、不产生抗药性、特异性强等特点,已引起研究者的广泛关注。有研究表明,口服的特异性IgY(在消化道黏液的作用下易被分解)在不与病原菌直接接触的情况下,对细菌感染引起的非消化道疾病起到了显著的治疗作用,据此,研究者推测IgY在体内可能以活性片段的形式与病原菌特异性结合,抑制病原菌在病灶处的定植与繁殖,从而发挥治疗疾病的作用。本研究分别采用体外酶解法和基因工程重组表达法制备特异性IgY活性片段,向其中加入荧光识别位点,以期借助体内荧光示踪技术考察特异性IgY活性片段在体内的走向及分布,从而为研究口服特异性IgY治疗非消化道疾病的作用机理提供实验材料和理论依据。体外酶解法采用嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫蛋鸡,制备IgY及其活性片段。间接ELISA表明,IgY的最高效价可达1：51200；经两步盐析,IgY的纯度由原来的30.5%提高到62.2%。免疫荧光和体外抑菌实验表明,特异性IgY与嗜水气单胞菌的结合为特异性结合。胃蛋白酶酶解IgY的SDS-PAGE和间接ELISA显示,胃蛋白酶作用于IgY24h能够将IgY彻底分解成Fab’和pFc’碎片；Western blot和体外抑菌实验结果表明特异性IgY酶解组分中的Fab’为IgY活性片段,其具有显著的体外抑菌性能。基因工程重组表达法以金黄色葡萄球菌为抗原,免疫蛋鸡,采集血液,合成cDNA,根据Genebank报道的鸡IgY可变框架区的序列分别设计IgY重、轻链可变区引物,PCR钓取IgY重、轻链可变区基因,基因测序,结果表明,重链可变区的片段大小约为390bp；轻链可变区均约为330bp。采用生物信息学方法对所得序列与现已报道的相关基因序列进行比较,初步筛选出4条特异性IgY可变区序列,VH2和VH7及VL1和VL4,分别连接pET28a载体,构建重组菌,IPTG诱导,结果发现VH2和VH7的诱导表达成功,且在E. coli BL21中的表达均为胞内可溶性表达；与对照组相比,VH2和VH7均具有显著地结合金黄色葡萄球菌的能力,且VH7的抗原结合活性显著高于VH2(P<0.05)。采用体外酶解法制备的特异性IgY酶解组分中含非特异组分,这将会干扰后续实验,因此,本研究更倾向于用基因工程重组表达法制备特异性IgY活性片段。综上,酶解法制备的特异性IgY酶解组分中具有体外抑菌活性和抗原结合活性的活性片段为Fab’；基因工程重组表达法成功表达出两个特异性IgY活性片段,分别为VH2和VH7。