论文部分内容阅读
微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核生物，几乎可以感染所有的脊椎动物和无脊椎动物，甚至包括人类。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是最早发现的微孢子虫，因其寄生感染家蚕而得名。其引起的家蚕微粒子病对世界养蚕各国都曾造成过毁灭性的危害，是目前蚕业唯一的法定检疫对象。由于微粒子病对养蚕业每年造成的经济损失巨大，因此对家蚕微孢子虫的研究一直是蚕病研究的重点。 微孢子虫表面包裹着一层致密的孢壁结构，在微孢子虫抵御外界不利环境、维持自身形态和渗透压等方面发挥着重要的功能。也正是由于孢壁的特殊结构，使微孢子虫的防治面临着巨大的挑战，因而受到了微孢子虫研究学者的广泛关注。围绕孢壁的研究目前主要停留在对孢壁蛋白的鉴定和功能的初步探索阶段，而对孢壁构成机理的研究则略显不足。本论文以不同方法提取到的家蚕微孢子虫为材料，探究了在微孢子虫生长发育过程中作为孢壁结构的几丁质层和其中一个孢壁蛋白NbSWP9蛋白易位的过程;通过分段表达和定点突变的方法，将已证实与几丁质壳存在结合关系的孢壁蛋白NbSWP9为研究对象，开展了二者结合作用分子基础的研究。主要结果如下: 1.家蚕微孢子虫在不同发育阶段中孢壁几丁质形成与孢壁蛋白NbSWP9分布情况分析以家蚕胚胎细胞（Embryonic cell line ofBombyx mori，BmE）体外培养家蚕微孢子虫、Percoll密度梯度分离纯化法以及胰酶消化感染N.bombycis的家蚕中肠组织三种方法得到的不同发育时期的家蚕微孢子虫为研究材料，采用特异荧光标记的方法，初步分析孢壁构成过程中几丁质形成和NbSWP9蛋白表达分布的过程。结果表明:家蚕微孢子虫孢壁几丁质在早期孢子母细胞时期便开始形成。NbSWP9在微孢子虫发育早期（裂殖体时期）可被检测到较强的荧光信号，该时期核物质定位信号清晰，而几丁质壳不能被相应染料着色;几丁质层的形成晚于NbSWP9的分泌，并且其荧光信号能与NbSWP9的荧光进行部分共定位，未共定位的部分显示几丁质层在内，NbSWP9在外;而当几丁质层荧光信号逐渐增强，暗示几丁质层发育完全形成时，NbSWP9的荧光减弱。由以上结果推测，可能随着孢壁结构不断堆叠增厚形成致密层的过程，NbSWP9主要与孢内壁几丁质层通过紧密结合参与孢壁的形成和稳定，导致抗原表位的不充分暴露。 2.NbSWP9与孢壁几丁质结合的关键功能基序的鉴定通过对NbSWP9预测分析的功能结构域进行截短，构建了缺失几丁质结合基序的NbSWP9突变体，并以去掉信号肽的NbSWP9作为野生型对照，原核表达获得两个融合表达的蛋白;利用脱蛋白几丁质壳(Deproteinated chitin spore coats，DCSCs)验证经信息分析预测的几丁质结合基序是否在与NbSWP9和几丁质层的结合过程中发挥作用。通过免疫印迹和间接免疫荧光分析结果表明，缺失几丁质结合基序的NbSWP9不能与家蚕微孢子虫脱蛋白几丁质壳结合，进而说明NbSWP9的几丁质结合基序在该蛋白与几丁质结合的过程中发挥作用。 3.NbSWP9与孢壁几丁质结合的关键氨基酸位点的鉴定通过对NbSWP9几丁质结合基序中4个保守的氨基酸位点进行定点突变，利用几丁质结合实验验证可能发挥重要功能的氨基酸位点。通过Overlapping PCR的方法成功构建4个NbSWP9的定点突变体: swp9-C206A、 swp9-C206A/G229A、swp9-C206A/N214A/G229A和swp9-C206A/N214A/V225 A/G229A。通过原核表达载体的构建、重组表达菌的诱导表达，经亲和层析纯化获得SWP9-C206A原核表达蛋白以及SWP9-C206A/G229A原核表达蛋白。对以上蛋白利用几丁质结合实验对其与几丁质壳的结合能力进行分析，结果表明SWP9-C206A/G229A蛋白与几丁质的结合作用减弱，而SWP9-C206A蛋白与几丁质的结合作用相比对照组无差异，说明NbSWP9几丁质结合基序末位甘氨酸可能在该结合过程中发挥作用。 综上所述，本研究首次通过体内和体外来源的微孢子虫材料对不同发育时期家蚕微孢子虫的几丁质形成和NbSWP9的分布情况进行了初步探索;通过分段表达的方法对孢壁形成过程中NbSWP9与几丁质层之间相互作用的分子基础进行了探究。