论文部分内容阅读
目的:新疆是我国五大牧区之一,在畜牧业方面拥有较大的发展空间。哈萨克羊是新疆地方粗毛羊品种,因其生产性能优良,肉质细嫩可口而深受当地人们的青睐。然而,哈萨克羊繁殖力较低且繁殖周期长的繁殖方式,使羊肉供给量远远不能满足市场需求。因此,探索提高哈萨克羊繁殖效率的新方法和新技术成为当下研究新疆绵羊养殖业的主要问题之一。抑制素α可通过内分泌负反馈调节途径选择性地抑制促卵泡素(FSH)的合成与分泌,从而影响动物的繁殖力。因此,本研究根据抑制素α(INHα)功能特点,运用生物信息学技术、蛋白质纯化技术、抗体纯化技术,获得免疫效价高的INHα抗原,再运用基因免疫方法将INHα主动和被动免疫哈萨克羊,进而研究INHα对哈萨克羊血液生殖激素含量的影响,为INHα在提高新疆绵羊繁殖效率研究中的作用机制提供参考数据,同时也为制备驼抗INHα抗体提供新思路。方法:(1)对INHα重组质粒原核表达菌株进行诱导表达条件的优化及鉴定,以镍柱亲和层析纯化法和尿素透析复性法收集表达蛋白,该蛋白用肠激酶酶切并对其进行二次纯化,用Western blotting鉴定蛋白的免疫原性,并对INHα蛋白进行生物信息学分析。(2)用经纯化的INHα重组蛋白免疫接种新疆双峰骆驼,制备驼抗INHα多克隆抗体,并对其进行纯化,用间接ELISA方法检测抗体效价,用Western blotting验证抗体与目的蛋白结合的特异性。(3)将45只哈萨克羊随机分为三组,分别为A组(INHα多克隆抗体免疫组)、B组(INHα重组蛋白免疫组)、C组(对照组),应用ELISA生殖激素检测试剂盒检测三组绵羊血液生殖激素含量,并对绵羊血液生化指标进行检测,最后用SPSS软件分析数据。结果:(1)INHα蛋白在37℃,终浓度为0.1mmol/L的IPTG中,诱导4h时以包涵体形式大量表达,纯化并肠激酶酶切后的INHα蛋白纯度高并具有免疫原性。生物信息学分析结果显示,INHα是含有信号肽,但无跨膜结构的一种不稳定脂溶性蛋白,在二级结构中,INHα包含的α螺旋占16.11%,β转角占3.06%,延伸链占16.94%,无规则卷曲占63.89%,INHα具有3种相似度高的三级结构模型,其中,模型二的C值得分最高并且可靠。(2)经过70天的免疫,双峰驼体内抗体效价达1:512000,该抗体可与INHα蛋白特异性结合。(3)在免疫INHα抗原前,三组间的FSH、LH、E2、INH、P4含量均处于平衡状态,各组间差异不显著(P>0.05)。而免疫后的A组FSH含量显著高于C组(P<0.05),B组FSH含量高于C组,但没有达到差异显著水平(P>0.05)。A组LH含量和B组LH含量均低于C组,但差异不显著(P>0.05)。A组P4含量和B组P4含量均高于C组,但差异均未达到显著水平(P>0.05)。A组的E2含量显著高于C组(P<0.05),B组E2含量高于C组,但差异不显著(P>0.05)。A组的INH含量显著低于C组(P<0.05),B组的INH含量低于C组,但差异不显著(P>0.05)。对绵羊血液生化指标进行检测,发现INHα蛋白和INHα多克隆抗体均没有对绵羊肝脏、心脏和肾脏功能产生副作用,该抗原具有安全性。结论:(1)成功诱导表达、并纯化出以包涵体形式存在的具有免疫原性的INHα蛋白。(2)INHα蛋白免疫使骆驼体内产生了大量抗体。(3)INHα蛋白主动和被动免疫对哈萨克羊生殖激素均产生一定的影响,但相比较被动免疫效果更佳,并且INHα蛋白和INHα多克隆抗体两种抗原没有对绵羊机体产生不良作用。