本实验采用组织块贴壁培养法,构建了鲁西黄牛、皮埃蒙特牛有限成纤维细胞系。并对所建细胞系进行了生物学特性研究与分析。 本实验所培养的细胞具有典型的成纤维形态:所培养细胞呈梭形或不规则三角形,有数个长短不一的突起,细胞丰满;细胞核形态为卵圆形,并位于胞质中央,核仁清晰。两种牛成纤维细胞大小不一致,且形态存在差异。对于所建细胞系,细胞冻存代数在4代以内,冻存密度为3×10~6/ml。鲁西黄牛的样本含量为8,冻存管数为40支;皮埃蒙特牛的样本含量为2,冻存管数为31支。 细胞复苏后活率较冻存前有所下降,这表明细胞在冷冻、复苏过程中可能受到一定的损伤。但活率均在90%以上。所培养细胞在体外的生长增殖过程呈“S”型,经历了潜伏期、指数增生期和平顶期三个阶段,符合细胞在体外生长的一般规律。 在对所建细胞系进行微生物检测时,我们对细胞污染中常见的细菌、真菌、病毒及支原体污染进行分析,结果均为阴性,表明培养物未受到细菌、真菌、病毒及支原体的污染。 对于所建细胞系,尤其是以保种为目的所构建的细胞系,遗传特性的稳定非常重要。因此对细胞系遗传稳定性的评估是一项必要的指标。本实验对培养物进行染色体分析得出:通过对鲁西黄牛与皮埃蒙特牛100个分裂相的观察,二倍体染色体数为2n=60;染色体形态未见异常;两个牛品种的亚二倍体与多倍体的出现率均不超过13%,表明细胞在体外培养时遗传性能稳定;不存在种间的交叉污染。通过对染色体的核型分析,为物种鉴定提供理论依据。 同工酶分析已被广泛的应用于物种分析,因此本实验对所建细胞系进行了乳酸脱氢酶(LDH)与苹果酸脱氢酶(MDH)的酶谱分析,表明不同物种各呈现其独特的条带,具有种属特异性。通过比较研究,得出细胞系之间不存在交叉污染的现象。 本实验所构建的成纤维细胞系符合ATCC的要求,成功的构建了两个牛品种的有限成纤维细胞系,达到了畜禽遗传资源在细胞水平上长期保存的目的;并开辟了物种保存的新途径,搭建了我国畜禽遗传资源细胞库构建和生物学特性研究的技术平台,为全国畜禽遗传资源在细胞水平的保存和研究提供技术与理论支持;为多方面的科学研究提供了宝贵实验材料。