论文部分内容阅读
研究目的听力障碍是2021年第四大致残因素。据世界卫生组织估计,全世界大约有15亿人患听力障碍,给社会和经济造成沉重负担。顺铂(顺二氨二氯铂(Ⅱ))是目前广泛应用于临床的一线肿瘤化疗药,但其使用会带来诸多副作用,其中之一为耳毒性。研究认为,顺铂引起的听力损失主要是由于诱导细胞发生氧化应激所导致,此外一些研究表明炎症可能是顺铂诱导听力损失的触发事件,并且耳毒性过程中发生的内质网(endoplasmicreticulum,ER)应激、自噬、坏死以及内在凋亡都可能导致内耳细胞死亡,但是顺铂引起耳毒性的确切机制仍不清楚。Myb基因编码的转录因子c-Myb,其正常表达对细胞存活极其重要,在胚胎期,c-Myb两个等位基因的缺失会导致胚胎死亡。c-Myb蛋白参与控制正常细胞和转化细胞的增殖和分化。在内耳的研究中,有报道称c-Myb表达在鸡耳基板内,可能在内耳发育中发挥作用。前期我们证实了 c-Myb在小鼠耳蜗毛细胞中表达,在新霉素损伤的耳蜗毛细胞中表达下调,并且在新霉素损伤的HEI-OC1细胞中发挥保护作用,然而,c-Myb在耳蜗毛细胞中发挥的作用及其调控机制依然不清楚,有待进一步研究。因此,本研究旨在探讨c-Myb在顺铂诱导的耳蜗毛细胞损伤中发挥的作用,阐明在体外和体内小鼠耳蜗毛细胞中上调c-Myb是否会改变毛细胞对顺铂损伤的敏感性及其潜在的分子调控机制,从而为感音神经性聋的防治提供新的潜在靶点。研究方法1.出生后(postnatal day,P)30天的C57BL/6小鼠腹腔注射顺铂(3 mg/kg),每天1次,连续7天。听觉诱发电位(auditory brainstem response,ABR)检测小鼠听力,免疫荧光染色,激光共聚焦观察、细胞计数检测小鼠耳蜗毛细胞的损伤情况,免疫印迹实验检测毛细胞内c-Myb表达水平的变化。2.构建c-Myb过表达的腺相关病毒重组载体(AAV-ie-mNeonGreen-C-Myb-HA,AAV-c-Myb)。明确病毒感染效率:体外培养P3小鼠耳蜗毛细胞,分别感染不同滴度(2×109、4×109、7×109、2×1010genome-containingparticles(GCs))的空载体(AAV-ie)60小时后,通过免疫荧光染色和细胞计数,确定不同滴度的病毒感染耳蜗毛细胞的效率,根据感染效率选择合适滴度的病毒。免疫印迹实验检测耳蜗毛细胞内的c-Myb表达水平的改变。3.培养小鼠耳蜗毛细胞感染2×1010 GCs的AAV-c-Myb或空载体AAV-ie后,加入30μM顺铂共培养48小时,免疫荧光染色和细胞计数对各组耳蜗顶、中、底回的内、外毛细胞数目进行计数和比较;TUNEL染色和cleaved caspase 3染色检测毛细胞(myosin 7a标记)凋亡,计数和比较各组耳蜗底回中TUNEL/myosin 7a和cleaved-caspase 3/myosin 7a双阳性细胞数目;Mito-SOX染色检测毛细胞中Mito-SOX Red荧光强度变化,计数和比较各组耳蜗底回Mito-SOX/myosin 7a双阳性细胞数目。4.给予P16小鼠圆窗膜注射1×1010 GCs的空载体AAV-ie,体内感染耳蜗毛细胞14天后,ABR检测小鼠听力。免疫荧光染色检测不同滴度的AAV-ie感染耳蜗毛细胞的效率,选择合适滴度的病毒;选定滴度的AAV-c-Myb行圆窗膜注射,体内感染P16 C57BL/6小鼠的耳蜗毛细胞14天,免疫印迹实验检测耳蜗毛细胞中c-Myb表达水平的相对变化。5.给予P16小鼠圆窗膜注射1×1010 GCs的AAV-c-Myb或空载体AAV-ie,14天后给予小鼠腹腔注射顺铂(3mg/kg),连续给药7天,ABR检测听力,免疫荧光染色和细胞计数观察各组小鼠耳蜗顶、中、底回内、外毛细胞的丢失数目,计数各组内毛细胞突触前标志物C末端结合蛋白2(C-terminal binding protein 2,Ctbp2)的点状颗粒(puncta)平均数目。TUNEL染色比较各组内、外毛细胞中TUNEL/myosin 7a双阳性细胞数目。6.c-Myb flox/flox小鼠与Prestin-CreER小鼠杂交后筛选双阳性的小鼠(Prestin;c-Myb-cKO),自P10腹腔注射他莫昔芬(3 mg/40g),每天一次,连续三天,P30时行ABR检测听力,免疫荧光染色和细胞计数观察两组毛细胞中c-Myb表达情况和毛细胞数目。P30时,每天给予Prestin;c-Myb-cKO小鼠腹腔注射顺铂(3 mg/kg),连续7天,ABR检测听力改变,免疫荧光染色、细胞计数、TUNEL染色,比较各组的内、外毛细胞丢失数目和TUNEL阳性内、外毛细胞数目。7.培养小鼠耳蜗毛细胞预感染2×1010 GCs的AAV-c-Myb或空载体AAV-ie 12小时后,加入30μM顺铂或30μM顺铂+LY294002共同培养48小时后,免疫印迹实验检测各组耳蜗毛细胞P-Akt/Akt信号通路变化;免疫荧光染色和细胞计数比较各组耳蜗毛细胞丢失数目变化。研究结果1.顺铂损伤后小鼠听力所有频率(4-32KHz)阈移较对照组的阈移显著增加,24、32KHz处阈移增加最明显;耳蜗底回的毛细胞数量较对照组有显著丢失;c-Myb表达水平较对照组显著下降。2.免疫荧光和细胞计数结果显示:2×1010 GCs的AAV-ie在体外感染耳蜗毛细胞顶、中、底回效率分别为 83.250±0.944%、80.470±2.976%、76.600±2.804%。免疫印迹结果证实AAV-c-Myb在体外感染耳蜗毛细胞60小时后,c-Myb表达水平相对于对照组的表达水平显著上调。3.免疫荧光染色和细胞计数结果显示培养的毛细胞经AAV-c-Myb或AAV-ie和顺铂处理后,顺铂+AAV-c-Myb组的耳蜗顶、中、底三回内、外毛细胞丢失数量、TUNEL/myosin7a双阳性的内、外毛细胞数量、cleavedcaspase 3/myosin7a双阳性的内、外毛细胞数量、Mito-SOX/myosin 7a双阳性内、外毛细胞的数量均显著少于顺铂+AAV-ie组的数量。4.1×1010 GCsAAV-ie圆窗膜注射后小鼠听力无变化;耳蜗顶、中、底回毛细胞感染效率分别为 94.587±1.381%、93.150±1.370%、86.320±2.228%;耳蜗内、外毛细胞数量与对照组的数量比较无显著差异。1 ×1010GCs AAV-c-Myb圆窗膜注射后,小鼠毛细胞中c-Myb表达水平较对照组的表达水平显著上调。5.圆窗膜注射1×1010 GCs AAV-c-Myb或者AAV-ie联合顺铂处理小鼠后,顺铂+AAV-c-Myb组小鼠所有频率(4~32kHz)的阈移显著低于顺铂+AAV-ie组小鼠的阈移,耳蜗底回内、外毛细胞丢失数目较顺铂+AAV-ie组的丢失数目显著减少;内毛细胞的Ctbp2标记的点状颗粒平均数目较顺铂+AAV-ie组的平均数目显著增多;耳蜗底回TUNEL/myosin7a双阳性内、外毛细胞数量显著少于顺铂+AAV-ie组的数量。6.免疫荧光染色显示在P30时,c-Myb-毛细胞条件性敲除鼠Prestin;c-Myb-cKO的外毛细胞中c-Myb表达水平较对照组的表达水平显著下调,而内毛细胞中c-Myb表达水平较对照组的表达水平无显著改变。顺铂处理后,顺铂+Prestin;c-Myb-cKO小鼠组4~32 kHz的所有频率下ABR阈移较顺铂+野生小鼠组的阈移显著增加;外毛细胞丢失数量较顺铂作用的野生小鼠丢失数量显著增加;TUNEL/myosin7a双阳性外毛细胞数量较顺铂作用的野生型小鼠组的数量显著增加。7.顺铂损伤耳蜗毛细胞后,磷酸化(P)-Akt/Akt的比率及P-PI3K(p85α)水平显著降低;与顺铂+AAV-ie组相比,顺铂和AAV-c-Myb共同处理的基底膜中p85α的蛋白表达水平和P-Akt/Akt 比值显著增加,而LY294002处理降低了 c-Myb对p85α水平及P-Akt/Akt 比率的影响。此外,相对于顺铂+AAV-c-Myb组,LY294002处理使顺铂+AAV-c-Myb+LY294002组的毛细胞丢失数量显著增加。研究结论本研究发现c-Myb在顺铂损伤的耳蜗毛细胞中表达降低,利用AAV在毛细胞中过表达c-Myb,在体外和体内顺铂暴露后可以显著促进毛细胞存活,减少毛细胞凋亡,降低毛细胞内ROS水平,并改善顺铂诱导的小鼠听力下降。c-Myb的保护机制可能通过激活毛细胞中的PI3K/Akt信号通路实现的。本研究工作的结果表明c-Myb可能作为预防顺铂诱导的毛细胞损伤和听力损失的新治疗靶点。