铜绿假单胞菌是严重烧伤、创伤、囊性纤维病变及晚期肿瘤患者死亡的重要原因，严重危害着人类的健康。而铜绿假单胞菌感染的治疗一直比较棘手，因该菌可通过多种途径对许多常用抗菌药物产生多重耐药性，如产生碳青霉烯类酶、改变抗菌药物作用的靶位、丢失外膜孔蛋白、表达多种药主动外排系统及形成生物膜等。而现有抗生素的作用范围主要是针对细菌细胞壁、DNA和蛋白质的生物合成过程中的某一个关键分子，如针对DNA合成的靶点只有DNA拓扑异构酶。[1]因此，迫切需要寻找抗铜绿假单胞菌药物作用的新靶点，以筛选新型抗生素更好地解决现有细菌的耐药性问题。于是，我们把目光投向了细菌在自然界中的天敌--噬菌体。　　 噬菌体是细菌的病毒，是一种非细胞结构的生命体，因此它进入宿主菌后必须利用宿主菌大分子合成机制和能量装置进行自身的复制，这是一个非常复杂的过程，涉及了众多的调控机制。在漫长的进化历程中，噬菌体发展出一套独特的机制来限制宿主菌的生长与繁殖，即噬菌体基因组编码产生某些特殊的蛋白分子，可与宿主菌生长、代谢的重要调控性蛋白结合，并使其钝化，从而阻断宿主的生长与繁殖，将宿主菌大分子合成机制和能量装置转向噬菌体自身的复制与增值，这就是所谓的“关闭宿主”功能(shut-off functions)[2]。　　 目前研究表明，噬菌体编码的蛋白与宿主蛋白间的相互作用在“关闭宿主”功能方面发挥了十分重要的作用，主要涉及噬菌体编码的某些蛋白分子与宿主菌的分裂、DNA复制、转录及翻译相关因子的相互作用。到目前为止，对已经完成测序的600多种噬菌体基因组序列分析表明，很大一部分预测的ORFs与现有数据库中的蛋白质序列无相似性；即使是人们研究最多的T4噬菌体，也有超过一半的ORF功能没有明确。可见，我们所掌握的基因组数据显示绝大部分噬菌体与宿主间的相互作用还不被人们所了解。而在而在噬菌体对宿主菌的整个感染过程中，噬菌体的早期基因表达至关重要，决定着整个感染周期的进展。因此本课题拟充分利用铜绿假单胞菌噬菌体基因组资源，通过二维电泳-质谱的蛋白质组学技术和基因芯片鉴定噬菌体早期蛋白表达以及相应的宿主基因表达的变化，进一步初步鉴定出与噬菌体早期蛋白相互作用的宿主菌蛋白。本课题的主要研究结果如下：　　 1.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3感染宿主菌PA3后蛋白质谱的表达变化：利用二维电泳-质谱技术分别在PaP3感染宿主后5min，10min，20min，30min，80min，120min，200min几个时间点检测PaP3与宿主所产生的差异表达蛋白。经过重复实验与归类分析，我们初步鉴定出22个宿主被抑制蛋白(主要包括核糖体蛋白、翻译延伸因子、鞭毛相关蛋白及分子伴侣)，15个宿主被诱导蛋白(主要涉及能量合成、糖、脂代谢及转运相关蛋白质)及12个噬菌体自身表达蛋白(主要为结构蛋白及未知功能蛋白)。　　 2.PaP3全基因组在感染宿主菌PA3过程中的分时期表达：利用基因芯片检测噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后不同时间其全基因组在转录水平的表达谱变化，并进行非监督层次聚类(hierarchical clustering)分析。利用蛋白质合成抑制剂氯霉素(Cm)和DNA复制抑制剂磷酸乙酸(PAA)实验确定PaP3全基因组的分时期表达情况。结果表明，根据时间表达模式的不同，PaP3全基因组可分为三大类：15个早期基因(ORF71-57)、35个中期基因(ORF56-22)及21个晚期基因(ORF21-1)。在PaP3基因组结构中，这三类基因各自串联分布且可能受不同的操纵子调控。　　 3.PaP3感染后宿主菌PA3的基因表达变化：利用基因芯片技术考察了PA3被PaP3感染后5min全基因组表达的变化，通过SAM分析、主成份分析、相关性分析、GoTermPie Picture分析、及差异基因的功能分类等分析，结果显示PA3的部分未知功能基因与转录调控因子的表达水平在被PaP3感染后显著下调，提示噬菌体感染早期可能对宿主菌的基因表达进行全局性调控，其中可能涉及噬菌体早期编码基因产物与宿主的相互作用。　　 4.根据蛋白质谱及基因表达谱分析选择若干噬菌体早期蛋白(ORF66-71)，构建细菌双杂交诱饵质粒，利用细菌双杂交技术筛选PA3基因组表达文库质粒，鉴定出可与噬菌体早期蛋白ORF66、ORF70相互作用的宿主菌蛋白124-PA2426、133-PA3351及133-PA3622。　　 综上所述，通过蛋白质谱及全基因组表达谱分析，我们对噬菌体感染宿主有了一个较为宏观的认识，初步确定PaP3感染过程中其早期、中期及晚期基因随时间有序表达，且宿主菌的基因表达在噬菌体感染早期即受到全局性调控；并从宏观落实到微观，从噬菌体早期蛋白入手，考察感染早期噬菌体蛋白和宿主的相互作用。本课题为深入了解噬菌体基因表达模式及生命复制周期奠定基础，并为全面了解噬菌体及宿主相互作用机制提供了基础，为进一步筛选抗铜绿假单胞菌感染的候选药靶提供新的思路与视角。