免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)是由多种病原菌产生,与免疫球蛋白之间以非抗原形式结合,是一种重要的致病因子。其中代表分子包括有部分大消化链球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L,Pp L)、链球菌(C群和G群)蛋白G(Streptococcal protein G,Sp G)和金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,Sp A)等等。这类分子是由数目不同的功能相似的单结构域组合形成。因其独特结合特性,该类分子在抗体纯化、鉴定,抗体吸附治疗和病原体特异性抗体检测等方面应用广泛。利用体外分子进化获得了由Sp A A Ig结合结构域和Sp A C Ig单结构域随机重新组合构成的重组分子Sp A-AC,该分子是由Sp A中的E、D、A、B、C和Sp G中的B2、B3各单结构域随机重组后,利用噬菌体展示技术筛选出来的具有高结合活性的重组IBPs。因此,为了获得具有更高结合活性的免疫球蛋白结合分子,本研究对Sp A的A和C结构域上Fc结合位点氨基酸进行随机突变,构建噬菌体展示文库A1C1,对Sp A的A和C结构域上Fc结合位点周围的氨基酸进行随机插入突变,构建噬菌体展示文库AI37CI20。本研究的研究目的是,期望获得对人Ig G结合能力明显增强的突变体,为细菌免疫球蛋白结构和功能的研究奠定了基础,可用于提高病原微生物感染的抗体检测效果,应用分子进化手段改进蛋白分子功能,用于提升抗体诊断试剂的检测效果。本研究共分为以下两个部分:第一部分Sp A单结构域突变体组合文库的构建构建符合体外筛选要求的Sp A单结构域A在29、30位氨基酸定点突变文库(A1)、Sp A单结构域C在36、37位定点突变文库(C1)和Sp A单结构域A在37位后插入3个氨基酸随机肽(AI37)、Sp A单结构域C在20位后插入3个随机连接肽(CI20),将A1、C1随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库A1C1,将AI37、CI20随机组合构建的噬菌体展示文库命名为库AI37CI20,两个文库的库容分别为3.0×106和2.0×106,滴度依次为2.3×1012和2.1×1012(TU/ml)。两个文库各自经过4、5轮亲和筛选,文库进化完全。将突变后的片段经Xba I处理,将处理后的定点突变A1、C1与插入突变AI37、CI20分别与同样处理并经CIAP消化的p CANTAB5S连接,转化E.coli TG1中,经M13K07拯救,获得2个AC突变体展示文库。在插入的噬菌粒上共16个单结构域中,A1:C1:AI37:CI20个数比为5:3:4:4,具有随机性。在插入的单结构域片段中,A C也等比例出现,表明2个文库突变位点碱基种类具有较好的随机性。以上结果说明构建的2个AC突变体组合噬菌体文库能满足用于体外进化筛选要求。第二部分人Ig G诱导的Sp A AC突变体组合文库体外进化研究以人Ig G包板,经过过吸附、洗脱、扩增几轮重复循环,对构建好的文库分别进行体外分子进化筛选,经过4、5轮筛选,文库中空噬菌体的完全消失,多结构域的高度聚集,提示文库进化完全。在筛选后的文库中,对出现的阳性克隆进行序列测定,Phage-Elisa进行功能验证。结果:以人Ig G对文库A1C1筛选获得AQ29K30AI29I30组合的高活性结合分子,对文库AI37CI20筛选获得AI-TQSA组合的高活性结合分子。总结(1)本研究成功构建了随机定点突变文库A1C1和随机插入突变文库AI37CI20。(2)以人Ig G包板,对两个噬菌体文库进行体外进化研究,获得了2种重新组合的组合分子AQ29K30AI29I30和AI37-TQSA。(3)Phage-Elisa功能验证组合分子AQ29K30AI29I30和AI37-TQSA的结合特性。