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以全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)为靶标,对采集得到的29个科48种植物共计65种样品进行了杀线虫活性初步筛选,并对白花除虫菊(pyrethrum cinerariifolium)、白亮独活(Heracleum candicans)和印楝(Azadirachta indica)三种植物的内生菌进行分离并筛选杀线虫活性菌株,在前期筛选的基础上,对白亮独活(Heracleum candicans)、夹竹桃(Nerium indicum)以及内生真菌MFF-1和PLF-1的杀线虫活性成分进行分离鉴定,取得以下结果:
1.对48种植物进行杀线虫活性筛选,获得有活性的植物30种(线虫致死率30%以上),其中马兰(Baphicacanthus cusia)、金钟花(Forsythia viridissima)、西域荆节花(Stachyurus himalaicus)、羽叶鬼灯檠(Rodgersia pinnata)、粗喙秋海棠(Begonia crassirostris)和掌裂叶秋海棠(Begoniapedatifida)6种植物在72小时内对全齿复活线虫(P.redivivus)的致死率超过80%;隋胥子(E.lathyris)、金钟花(F.viridissima)、滇润楠(M.yunnanensis)、夹竹桃(N. indicum)、三分三(A.acutangulus)、掌裂叶秋海棠(B.pedatifida)、中华秋海棠(B.cathayana)和白亮独活(H. candicans)8种植物对松材线虫(B.xylophilus)的致死率超过80%,分别占筛选植物总数的12.5%和16.67%,以上植物除夹竹桃(N.indicum)外均为首次发现具有杀线虫活性。
2.从白花除虫菊(P.cinerariifolium)中分离到内生菌233株,其中活性内生真菌和活性内生细菌分别有11株和10株。72h内对全齿复活线虫(P.redivivus)致死率达到100%的内生真菌有LFF-2,MCF-1和MFF-1三株,内生细菌有LFB-4、YLB-3和MFB-4三株;对松材线虫(B.xylophilus)致死率达到100%的内生真菌有LRF-1,MCF-1和MFF-1三株,内生细菌只有MCB-1一株。从白亮独活(H. candicans)中分离得到的104株内生菌中,活性内生真菌和活性内生细菌分别有4株和6株。其中72h内对松材线虫(B.xylophilus)致死率达到100%的内生真菌只有LCF-1一株,没有内生细菌。从印楝(A.indica)中分离得到的65株内生菌中,活性内生真菌和活性内生细菌分别有3株和2株。其中72h内对全齿复活线虫(P.redivivus)的致死率达到100%的内生菌是PLF-1。在获得的活性菌株中,白花除虫菊(P.cinerariifolium)内生真菌MFF-1和印楝(A.indica)内生真菌PLF-1活性稳定,发酵液接近于中性,值得进一步研究。
3.从白亮独活(H.candicans)根的提取物中分离得到活性化合物8-geranyloxypsoralen(1)、imperatorin(2)和heraclenin(3)。从夹竹桃(N.indicum)枝的提取物中分离得到活性化合物3β-O-(β-D-diginosyl)-14,15α-dihydroxy-5a-card-20(22)-enolide(J-1)、Uzarigenin(J-2)和Cardenolide N-1(J-3)。化合物J-1为新化合物。活性测定表明:化合物1、2和3对全齿复活线虫(P. redivivus)和松材线虫(B.xylophilus)的致死中浓度(LC50)分别为274.0和188.3 ppm,179.0和161.7 ppm,148.7和114.7 ppm。化合物J-1、J-2和J-3对全齿复活线虫(P.redivivus)和松材线虫(B.xylophilus)的致死中浓度(LC50)分别为49.0和103.3 ppm,62.7和257.0 ppm,29.1和242.9 ppm。对照阿维菌素对松材线虫(B.xylophilus)有强的毒杀作用,致死中浓度(LC50)为0.120 ppm,但在浓度为200ppm时对全齿复活线虫(P.redivivus)无活性。
4.从内生真菌MFF-1的发酵液的提取物中分离得到活性化合物Wd1和Wd7,经鉴定其结构为wortmannin和(E)-3-(1-hydroxybut-2-eny1)-2,3-dihydrobenzofuran。从内生真菌PLF-1的菌丝的提取物中分离得到活性化合物1-((2R*,4S*,5S*)-2-CMoro-4-methyl-1,3-oxazinan-5-y1)ethanone (1)2,3-Dihydro-2-isopropenyl-5-benzofuranmethanol (2)和2’,4’-Dihydroxyacetophenone(3)。化合物Wd7和1为新化合物。活性测定表明:在浓度1000ppm时Wd1和Wd7对全齿复活线虫(P.redivivus)表现出一定的毒杀活性,72h内的致死率分别为47.6%和31.4%,同时化合物Wd1对多种病原微生物具有抑菌活性。内生真菌PLF-1的活性化合物1、3在72h内对全齿复活线虫(P.redivivus)和松材线虫(B.xylophilus)的致死率分别是71.4%和70.5%,67.2%和63.7%。