背景和目的骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤。肺转移是目前最常见的死亡原因,一旦发生预后明显变差,不可切除的肺转移死亡率几乎达100%。如何提高肺转移治愈率一直是临床研究的热点和难点。临床上约50%患者的肺转移是在治疗过程中出现的。如果能在治疗早期采用某种方法阻止肺转移的发生,将明显提高骨肉瘤的治愈率,是减少肺转移致死率的最佳方法。肿瘤的远处转移是一个多步骤、多环节共同参与的复杂过程,众多活性因子参与其中。Ezrin被认为是肿瘤转移各环节、各通路的中心调控因子。已经发现Ezrin与多种恶性肿瘤的预后和转移相关。2001年,Khanna最先发现Ezrin在高转移骨肉瘤细胞株明显过度表达。后来,进一步研究证实抑制Ezrin表达能显著下调骨肉瘤细胞在肺内的存活能力。提示Ezrin可能成为基因治疗抑制骨肉瘤转移的一个靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是最近发展起来的一种高效的基因沉默技术,具有特异性强、效率高、操作简单、沉默程度可控、实验周期短、适用范围广、费用低等无可替代的优点。因而,一经发现就得到了迅猛发展,现已广泛用于基因功能、肿瘤、抗病毒治疗等方面的研究。目前关于Ezrin参与肿瘤转移方面的体内研究主要采用的是实验性肺转移模型,由于模型动物的限制不能如实反映临床骨肉瘤肺转移的过程,也不能研究Ezrin对原发灶的影响。因此本实验拟在以上研究的基础上,通过构建抑制Ezrin蛋白表达的shRNA干扰重组载体,下调UMR106大鼠骨肉瘤细胞株Ezrin蛋白的表达,体外研究干扰前后细胞增殖、运动、粘附和侵袭能力的改变;并以大鼠原位骨肉瘤荷瘤鼠做为肿瘤模型,体内观察Ezrin蛋白干扰对骨肉瘤肺转移及原位瘤生长的影响,为研究抑制骨肉瘤肺转移的基因治疗方法提供理论依据。方法⑴按照Elbashir等及Reynolds的设计原则设计并合成针对Ezrin蛋白编码基因villin2的shRNA,并克隆入转录载体pGenesil-1,构建重组质粒pshRNA1-villin2,pshRNA2-villin2和pshRNAHK-villin2(阴性对照质粒);中量提取重组质粒,采用LipofectamineTM 2000转染UMR106骨肉瘤细胞,应用RT-PCR和Western Blot法分别在mRNA和蛋白水平检测villin2基因的干扰效果。⑵应用干扰效果较好的质粒大量转染UMR106细胞,体外应用MTT、细胞粘附实验和Transwell小室分别研究Ezrin蛋白干扰后细胞增殖、粘附、运动和侵袭能力的变化。⑶采用UMR106细胞原位移植法构建高肺转移率的大鼠骨肉瘤模型。分别用无血清培养基和鼠尾胶稀释扩增培养的UMR106细胞形成混悬液,原位移植至3周龄SD大鼠胫骨近端骨髓腔内,并给予免疫抑制剂和抗感染药物。观察肢体成瘤及肺内转移情况,X线检查骨质改变状况,HE染色组织学检查确定病变性质。⑷应用G418筛选稳定转染重组质粒的UMR106细胞并进行大量扩增,按照⑶的方法建立SD大鼠原位移植骨肉瘤,以正常细胞及阴性对照质粒转染细胞的移植模型做对照,观察原位肿瘤出现时间、大鼠生存时间及肺转移的差异,并采用荧光显微镜和RT-PCR技术研究Ezrin蛋白被干扰细胞的体内分布。结果⑴成功构建三个重组质粒,分别为pshRNA1-villin2、pshRNA2- villin2和通用阴性对照质粒pshRNAHK-villin2;应用LipofectamineTM 2000将上述重组质粒成功转染至UMR106骨肉瘤细胞内,转染效率高达90%。RT-PCR检测显示villin2基因在mRNA转录水平被显著抑制,pshRNA1-villin2和pshRNA2-villin2分别抑制到正常细胞的23.12%和30.25%。Western Blot检测结果与RT-PCR相似,pshRNA1-villin2和pshRNA2- villin2分别将Ezrin蛋白抑制到正常细胞的12.32%和25.56%,pshRNA1-villin2干扰效果较好。⑵以重组质粒pshRNA1-villin2转染UMR106细胞干扰Ezrin蛋白表达后细胞发生以下变化:①细胞增殖能力减弱,增殖抑制率达26.63%±20.65%;②细胞粘附力降低,仅为正常细胞的52.9%;③细胞运动及侵袭能力均降低,抑制率分别45.34±5.91%和50.69±5.96%。⑶UMR106细胞混悬液原位移植SD大鼠胫骨近端骨髓腔成功构建了高肺转移的大鼠骨肉瘤模型,原位成瘤率及肺转移率均达100%。X线检查示明显骨质破坏和瘤骨形成,组织学检查见肿瘤样骨基质形成,符合临床骨肉瘤各项特征。培养基稀释组较鼠尾胶稀释组肿瘤形成时间早(10.0±1.65天vs 17.8±0.87天,p<0.0001),肺转移灶数目多(155.25±36.63个vs 91.5±29.56个,p<0.0001),大鼠生存时间短(21.4±6.67天vs 40.6±9.52天,p<0.0001)。⑷以重组质粒pshRNA1-villin2转染UMR106细胞,G418筛选并扩增培养2个月,UMR106的稳定转染细胞达细胞总数的50%以上,RT-PCR检测示mRNA为正常细胞的60.25%,Western Blot检测Ezrin蛋白降至正常细胞的50.56%。将筛选后细胞原位移植大鼠胫骨近端,结果证实:①Ezrin蛋白干扰后并未影响UMR106细胞原位肿瘤的形成,成瘤时间与正常细胞组和阴性对照组间无统计学差异(10.17±0.90天vs 10.17±0.95天和10.08±0.88天,p>0.05);②存活时间较正常细胞组和HK阴性对照组明显延长(42.8±17.28天vs 21.3±6.72天和22.4±7.42天,p< 0.0001);③肺转移灶数目明显少于正常细胞组和HK阴性对照组(60.9±57.78个vs 120.4±41.92个和117.6±36.48,p<0.0001);④荧光显微镜和RT-PCR检测均证实Ezrin蛋白被干扰的稳定转染细胞只存在于原位瘤,而未转移到肺组织。结论⑴重组质粒pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2均能有效抑制UMR- 106骨肉瘤细胞内Ezrin蛋白的表达,以pshRNA1-villin2干扰效果最好。⑵Ezrin蛋白在细胞的增殖、粘附、运动和侵袭中起重要作用,Ezrin蛋白下调后可使细胞的上述能力减弱,转移能力降低。⑶UMR106细胞混悬液原位移植SD大鼠胫骨近端构建的大鼠骨肉瘤模型肺转移率高,适合于骨肉瘤肺转移的研究。用无血清培养基重悬细胞成瘤早,肺转移灶多,大鼠存活时间短,适合肺转移机制方面的研究;鼠尾胶重悬细胞成瘤时间稍晚,肺转移数目略少,大鼠存活时间长,可用于肺转移治疗方面的研究。⑷Ezrin蛋白不影响骨肉瘤原位肿瘤的生长,但是肺转移的必需因子,抑制Ezrin蛋白的表达就能抑制骨肉瘤肺转移的发生。因此Ezrin蛋白可以作为预防骨肉瘤肺转移基因治疗的靶点。