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目的(1)建立大鼠原位肝移植动物模型,总结手术技巧和方法,为下一步实验提供稳定的动物模型。(2)观察Wistar大鼠到Sprague- Dawley(SD)大鼠异系肝移植后急性排斥反应(acute rejection, AR)、Sprague-Dawley(SD)大鼠到Sprague-Dawley大鼠同系肝移植后免疫耐受(immunotolerance)的基本病理生理指标变化。(3)观察移植肝脏中IFN-γ、IL-10信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)的表达及血清中IFN-γ、IL-10水平的改变。通过以上实验,探讨Th1/Th2细胞因子在肝脏移植免疫耐受中的作用。方法(1)采用改良“二袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型,即用连续缝合法吻合肝上下腔静脉,用袖套法吻合门静脉及肝下下腔静脉,胆管用内支架法完成胆道重建。术后观察大鼠存活率和生存质量,总结手术技巧、经验和方法,掌握成熟稳定的建模技术。(2)按上述方法建立大鼠原位肝移植模型,实验分3组进行:对照组(正常SD大鼠假手术组)、异系移植组(Wistar-SD)及同系移植组(SD-SD)。所有进入实验组的受体大鼠必须能够稳定存活7d及以上。每一组样本量均为12对大鼠,各组大鼠于术后第7d随机选取其中的6只活杀采集标本进行各项指标的检测,剩余的6只观察其存活情况。具体按照以下方法进行实验指标的检测和观察:①观察肝移植后大鼠的2周存活率。②肝脏病理检查:光镜、电镜观察移植肝脏组织病理及超微结构的病理改变。③酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各样本大鼠血清IFN-γ及IL-10的含量。④逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察移植肝脏中IFN-γmRNA及IL-10 mRNA的表达。⑤各组间均数的比较采用均数±标准差(±s)表示,统计学方法采用t检验,组间生存率比较采用Log-rank法检验,用SPSS 13.0软件进行统计分析,P<0.05表示差异有显著性。结果(1)两组大鼠原位肝移植主要手术步骤所需时间稳定且无明显差异,在未用免疫抑制剂情况下,同系移植组大鼠无急性排斥表现(Williams标准),14d生存率为100%;异系移植组大鼠14d内全部死亡,术后第7d肝组织病理改变出现典型急排反应(Williams标准)。(2)病理学检查发现,同系移植组移植肝脏组织形态学改变较轻,光镜下肝细胞轻度变性浊肿,肝血窦轻度扩张,汇管区少量炎性细胞浸润,肝小叶结构基本正常;电镜下超微结构改变较轻,内皮细胞轻度肿胀,毛细胆管微绒毛基本正常;异系移植组表现为肝细胞变性重,有较多坏死细胞,肝血窦显著扩张充血,汇管区大量炎性细胞浸润,肝小叶结构破坏,有髓鞘样结构形成;内皮细胞肿胀明显,胆管上皮细胞肿胀,微绒毛脱落。(3)肝组织中Th1细胞因子IFN-γmRNA的半定量结果显示:对照组、同系移植组和异系移植组分别为:0.41±0.03、0.48±0.03和0.77±0.02, IFN-γmRNA在异系移植组移植肝脏中表达较同系移植组明显增强(P<0.05);Th2细胞因子IL-10 mRNA的半定量结果,对照组、同系移植组和异系移植组分别为:0.32±0.02、0.55±0.04和0.39±0.04,IL-10 mRNA的表达在异系移植组移植肝脏中较同系移植组明显减弱(P<0.05)。(4)血清IFN-γ、IL-10含量检测结果显示:IFN-γ对照组为87.83±8.67 pg/ml,同系移植组为159.83±16.53 pg/ml,异系移植组为386.67±14.36 pg/ml;IL-10对照组为70.50±7.23pg/ml,同系移植组为288.33±17.10pg/ml,异系移植组为126.33±13.10 pg/ml,三组之间均差异显著(P<0.05)。以上研究结果提示大鼠肝移植后免疫耐受的形成与IL-10呈正相关,与IFN-γ呈负相关。结论:(1)大鼠原位肝移植手术难度大,需要娴熟的显微外科技术和耐心细致的手术操作。采用改进的“二袖套法”可以简化手术术式,提高手术成功率,为下一步活体实验提供稳定的建模方式。(2)在未用任何免疫抑制剂情况下,Wistar大鼠与SD大鼠的组合方式,可以建立稳定的急性排斥模型,大鼠术后第7天具有典型的急性排斥反应指标表现;同种异体SD大鼠肝移植后能产生免疫耐受。(3)Th1/Th2细胞因子的动态平衡在大鼠肝移植免疫耐受中起着重要作用,Th1向Th2细胞发生免疫偏离是移植耐受的机制之一。