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构建一种能有效介导目的基因表达,对正常组织细胞低毒,并能抗血浆蛋白非特异性吸附的基因传递载体,是肿瘤基因治疗领域的重要课题。生长抑制因子4(ING4)和白介素-24(IL-24)基因分别能够从细胞内、外两条途径抑制肿瘤细胞生长。柞蚕丝素蛋白具备良好的生物相容性,可被生物降解。聚乙二醇(PEG)具有抗血浆蛋白的非特异性吸附的能力。在PEG支链上接枝基质金属蛋白酶敏感肽(MMP2敏感肽,序列为GPLGIAGQC)后,PEG链可在肿瘤细胞外高度表达的MMP2的作用下断裂,从而增强肿瘤细胞对复合物颗粒的内化作用。本文的目的是构建一种以柞蚕丝素蛋白为基础的新型ING4-IL-24双基因共表达质粒传递载体。为了降低非特异性吸附,延长载体的体内循环时间,在该载体的表面接枝PEG-MMP2敏感肽支链。当载体到达高表达MMP2的肿瘤细胞表面后,载体表面的PEG链可在MMP2作用下断裂。为了实现上述目标,本文首先用分枝状低分子量聚乙烯亚胺(PEI)对柞蚕丝素蛋白(ASF)进行化学改性,使柞蚕丝素蛋白的表面由带负电荷翻转为带大量正电荷,制得阳离子化柞蚕丝素蛋白(CASF)。再将PEG-MMP2敏感肽共价接枝于CASF的侧链上,制备经PEG-MMP2敏感肽接枝改性后的阳离子化柞蚕丝素蛋白(CASFMP)。然后用CASFMP包被、压缩ING4-IL-24双基因共表达质粒DNA获得CASFMP/pDNA复合物。用不同质量比的CASFMP/pDNA复合物分别体外转染高表达MMP2的人纤维肉瘤细胞HT1080,以及人正常胚肾细胞HEK293,研究复合物对恶性肿瘤细胞的转染能力和抑制生长能力,以及对正常细胞的毒性。首先,ASF侧链上的羧基在碳化二亚胺作用下被激活后,与PEI的氨基发生酰胺化反应,使ASF表面电荷由负电荷翻转为正电荷,得到阳离子化柞蚕丝素蛋白。CASF的表面Zeta电位随着PEI/ASF质量比的增加而增大。当PEI/ASF的质量比为4%时,柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位为+10.76±0.40 mV,等电点为9.38,且柞蚕丝素蛋白侧链上的自由氨基数量显著增多。经FT-IR和1H-NMR表明PEI接枝到柞蚕丝素蛋白侧链上。其次,PEG-MMP2敏感肽在双功能交联剂3-(2-必定二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)的作用下偶联于CASF侧链上,得到经PEG-MMP2敏感肽接枝改性的阳离子化柞蚕丝素蛋白,PEG-MMP2敏感肽-CASF(CASFMP)。当PEG-MMP2敏感肽/CASF质量比为1/500、1/400、1/300时,CASFMP的表面Zeta电位随着PEG-MMP2敏感肽/CASF质量比的增加略增大。当PEG-MMP2敏感肽/CASF质量比为 1/200、1/100、1/50 时,CASFMP 的表面 Zeta 电位随着 PEG-MMP2 敏感肽/CASF质量比的增加而减小。FT-IR和1H-NMR表明,在SPDP作用下PEG-MMP2敏感肽以二硫键的形式连接CASF侧链。凝胶蛋白电泳表明,PEG链在基质金属蛋白酶MMP2作用下可从PEG-MMP2敏感肽-CASF中有效被裂解。然后,通过静电吸附作用,表面带正电荷的CASFMP包裹、压缩带负电荷的质粒DNA形成CASFMP/pDNA复合物。琼脂糖凝胶电泳表明当CASFMP/pDNA质量比为64/2、128/2、196/2时,三种比例的CASFMP均可有效包裹质粒DNA。三种比例复合物的表面Zeta电位均为正值。复合物均形成结构致密、类似球形的纳米颗粒,且在水溶液和血清环境下均匀分散,无相互聚集,说明偶联于CASFMP/pDNA复合物的PEG链能够有效地屏蔽复合物颗粒与血清蛋白之间的相互作用。最后,用CASFMP/pDNA复合物体外转染高表达MMP2的HT1080细胞,以及HEK293细胞。复合物转染HT1080细胞24 h后,细胞开始变圆,部分细胞开始漂浮,且细胞存活率显著低于空白对照组,说明CASFMP/pDNA复合物能抑制HT1080细胞增殖。当C50ASFMP/pDNA质量比为128/2时,复合物转染的HT1080细胞的效率高于复合物转染正常细胞HEK293的效率,说明CASFMP中的PEG支链能够在MMP2作用下被裂解,增强复合物对HT1080细胞的转染效率。而复合物转染HEK293细胞24 h后,细胞充分伸展且细胞存活率均为95%以上,显著高于25 kDa PEI/pDNA复合物,表明与25 kDa PEI/pDNA复合物相比,CASFMP/pDNA复合物对HEK293细胞的毒性更低。本文构建的以聚乙二醇支链可裂解的阳离子化柞蚕丝素蛋白为基础的ING4-IL-24双基因共表达质粒传递系统,能有效抑制人纤维肉瘤细胞HT1080的生长,对正常组织细胞无明显毒性,并具备抗血浆蛋白的非特异性吸附能力。实验证明,CASFMP支链上的PEG能够在MMP2作用下被裂解,有助于提高其装载的基因对高表达MMP2的恶性肿瘤细胞的转染效率。本文的研究为恶性肿瘤的基因治疗提供了一种高效、安全的基因传递载体。