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第一部心脏多巴胺D5受体通过氧化应激和PKG-ERK1/2/AKT在扩张型心肌病发病机制中的研究 扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)是一种以心腔扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征的进行性心肌疾病，但是它的形成机制到现在尚未完全清楚。前期研究发现多巴胺D5受体基因敲除(D5-/-小鼠)小鼠血压明显升高，心脏重量增加、心肌肥厚;全身表达D5突变基因D5F173L(CMV-D5F173L)基因的转基因小鼠，自3月龄开始血压升高，4月龄开始左心室肥大，均显示多巴胺D5基因与心肌病的发生发展密切相关，但其调控机制并不清楚。因此我们建立了心脏特异表达D5F173L转基因小鼠，该小鼠表现出典型的扩张型心肌病表型。为此，本课题拟利用心脏特异表达D5F173L转基因小鼠，以及D5受体基因转染的H9C2细胞，探讨多巴胺D5受体在扩张型心肌病发生发展中的作用机制。 方法: 利用已经建立的3月龄心脏特异表达人多巴胺D5受体突变基因F173L(α-MHC-hD5F173L)和正常基因(α-MHC-hD5WT)转基因小鼠，首先检测比较转基因小鼠心脏内ROS的产量和NOX2的表达量。然后对α-MHC-hD5F173L小鼠通过腹腔注射NADPH氧化酶的抑制剂罗布麻宁(Apocynin)4周，同时给PBS作为对照组，然后检测各项心肌病相关指标。同时构建转染人多巴胺D5受体突变基因(hD5F173L)和正常多巴胺D5受体基因(hD5WT)大鼠心肌细胞(H9C2)，检测两者在基础条件下ROS产量的变化。为了验证PKA或PKG是否参与到调节通路中，我们分别以蛋白酶A抑制剂H89、蛋白酶G抑制剂KT5823刺激，检测其ROS的产量、NOX2以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外信号调节激酶1/2的表达量。 结果: α-MHC-hD5F173L转基因小鼠的NADPH氧化酶的活性和NOX2以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外信号调节激酶1/2蛋白的表达量均明显高于野生型α-MHC-hD5WT小鼠。罗布麻宁(Apocynin)能显著减少α-MHC-hD5F173L转基因小鼠的上述各项指标。H9C2-hD5F173L大鼠细胞系NOX2以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外信号调节激酶1/2蛋白的表达量亦高于H9C2-hD5WT对照细胞。PKG抑制剂KT5823则使得大鼠细胞系NOX2以及丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和细胞外信号调节激酶1/2蛋白的表达量增加，而PKA抑制剂H89对受试细胞则无明显作用。 结论: 多巴胺D5受体可能通过PKG途径调节ERK1/2和/或AKT的表达量，从而引起的活性氧(ROS)产量改变，进而影响扩张型心肌病的发生发展。但是，其具体的作用机理还有待于进一步研究。 第二部血小板NHE-1在盐敏感性高血压发病机理研究 高血压是一种由多基因、环境等多种因素引起的复杂慢性疾病。高血压分为原发性高血压和继发性高血压两种，其中90％-95％的高血压为原发性高血压。盐敏感性高血压是原发性高血压的一种特殊类型，盐的摄入在其发展中扮演着关键的角色，但盐如何参与其发生发展的机制仍不十分清楚，近几年的研究发现，血小板介导的炎症反应是心血管疾病发生发展的重要影响因素。人体研究报道，盐敏感高性血压人群作为血小板活化的重要标志物P-选择素的含量增加。通过动物实验发现，盐敏感高血压大鼠高盐喂养后，血压升高，血小板功能异常，血小板内钙离子浓度增加，因此，我们假设:对于盐敏感性高血压个体，高盐诱导血小板表面钠氢离子泵活化，引起细胞内钙离子浓度增加，导致血小板活化从而引起炎症反应，最终导致血压的升高。 本实验通过体内、体外实验检测高盐负荷后Dah1盐敏感大鼠及对照大鼠血小板表面的NHE-1表达量、血小板活化及炎症反应情况，以期探索血小板表面NHE-1在盐敏感性高血压发病机制中的作用。 方法: 本研究从在体和离体实验两方面对血小板表面的NHE-1在盐敏感性高血压发病机制中的作用进行探讨。 1.在体实验:Dah1盐敏感性高血压大鼠及其对照组盐耐受大鼠高盐(8％NaCl)和低盐(0.12％NaCl)喂养四周后，测定Dah1大鼠及其对照组的血压。通过流式细胞术检测血小板活化率、血小板内钙离子浓度以及血小板表面的钠氢交换体1(NHE-1)的表达量;免疫印迹法检测肾脏多种炎症因子(IL-6、IL-1、NFκB)的表达量。 2.离体实验:将富集后的SD大鼠血小板血浆，分为对照组、高盐组、高盐给药组，给予不同盐浓度(0.9％ NaCl，1.3％NaCl)刺激30分钟后，高盐给药组再给NHE-1抑制剂HOE642预刺激15min，检测血小板活化率、血小板内钙离子浓度、NHE-1的表达量。 结果: 在体实验:高盐喂养四周后，Dah1盐敏感大鼠的血压较对照组盐耐受性大鼠显著升高(P＜0.05)，同时，血小板活化率显著上升(P＜0.05)，血小板胞浆内钙离子浓度明显升高(P＜0.05)，血小板表面NHE-1表达量增加(P＜0.05)。 离体实验:高盐组血小板活化率、血小板钙离子浓度及NHE-1的表达量明显高于对照组，NHE-1抑制剂HOE642抑制了高盐诱导而升高的血小板表面NHE-1的表达量，血小板内钙离子浓度和血小板活化率(P＜0.05)。 结论: 高盐摄取可能通过活化血小板细胞膜的NHE-1离子通道而激活血小板，进而诱导了炎症反应和盐敏感性高血压的发生发展。