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肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）是我国手足口病流行的主要病原体之一。EV71感染引起的致死性神经系统并发症与炎症反应密切相关,但EV71感染引起的神经系统炎症反应的分子机制尚不明确。补体（Complement,C）在宿主防御病原微生物感染和维持机体免疫稳态中发挥重要作用,而补体异常活化则诱发炎症反应。目前研究提示,在感染和非感染性脑炎模型中均可发现补体活化片段重要成员C5a介导的炎症反应能够加速疾病进展。因此,为预防和治疗EV71引起的神经系统损伤,本研究深入探讨C5a与其受体C5aR相互作用介导的炎症反应在EV71感染致小鼠神经系统损伤中的作用。目的本研究拟联合体内外实验,明确星形胶质细胞补体C5a/C5aR通路在EV71感染致神经系统损伤中的作用及机制。方法1.EV71感染U87-MG 3、6、9、12和24小时（hour past infection,hpi）后,倒置显微镜下观察U87-MG感染不同时间后的细胞状态;MTT法检测各感染时间组的细胞活力;q PCR检测感染组细胞中VP1基因水平;ELISA法检测各组细胞上清培养液中白细胞介素（Interleukin,IL）-6、IL-8、TNF-α水平;Western Blot法检测星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）水平、细胞中病毒VP1、3C、3D表达水平及补体成分C1q、C5aR蛋白水平;免疫荧光法检测各组细胞补体成分C3、C5a表达水平。C5a/C5aR通路抑制剂PMX53和EV71病毒共干预U87-MG 24h后,ELISA检测细胞上清培养液中IL-6、IL-8、TNF-α水平。Western Blot检测不同感染组中GFAP、C5aR表达水平。2.EV71感染4日龄C57BL/6J乳鼠:同窝4日龄小鼠随机分到EV71感染组和对照组,感染组小鼠腹腔注射EV71（2×10~6pfu/只）,对照组细胞上清培养液腹腔等量注射。记录并评估感染组、对照组小鼠感染后1～7天（day past infection,dpi）的体重、临床评分和生存率。乳鼠感染EV71（3 dpi、5dpi、7 dpi）安乐死并收集完整脑组织。q PCR检测各组脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平;免疫荧光法检测各组脑组织补体成分C3、C5aR、p C5aR蛋白变化;Western Blot检测脑组织中GFAP、C3、C1q、C5aR蛋白水平。EV71、细胞上清培养液、PMX53、PMX53c组合成不同干预条件后,腹腔干预4日龄C57BL/6J乳鼠,干预后每日监测并评估小鼠体重、临床评分和生存率。3.EV71感染U87-MG不同时间后收集细胞总蛋白,Western Blot检测MAPKs信号通路蛋白变化。PMX53与EV71共感染U87-MG 24h,Western Blot检测p38 MAPK信号通路变化。p38 MAPK通路抑制剂PD169316和EV71共感染U87-MG 24h后,ELISA检测各组细胞上清培养液中IL-6、IL-8、TNF-α的水平。Western Blot检测不同感染组GFAP、VP1以及p38 MAPK通路变化。C57BL/6J乳鼠感染EV71（2×10~6pfu/只）后,收集脑组织并进行Western Blot和免疫荧光检测,分别检测p38 MAPK通路变化、pp38与GFAP免疫荧光共定位情况。结果1.随着感染时间的增加,U87-MG细胞出现明显病变、活力降低;EV71直接感染U87-MG并在细胞内快速复制;细胞中病毒蛋白VP1、3C、3D显著增加;U87-MG感染EV71后所分泌的IL-6、IL-8、TNF-α水平随着感染时间增加不断升高;EV71感染诱导U87-MG补体系统相关蛋白C3、C5a、C1q、C5aR表达明显增加。PMX53干预可显著抑制EV71诱导的IL-6、IL-8、TNF-α水平（P＜0.05）和GFAP表达。2.EV71感染后的乳鼠出现四肢麻痹等神经系统损伤症状。与对照组相比,感染组小鼠8 dpi内,出现明显的体重下降、临床评分升高、生存率下降。感染组小鼠脑组织炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平明显升高,C5a/C5aR通路相关蛋白C1q、C3、C5aR、p C5aR1及GFAP蛋白水平表现上调。但PMX53干预可提高EV71感染小鼠的生存率和减轻EV71感染引起的临床症状。3.体外结果表明EV71感染可激活U87-MG中p38 MAPK通路。而PMX53干预可抑制p38 MAPK通路激活;PD169316抑制剂干预可降低病毒在细胞中的复制、星形胶质细胞活化以及炎症细胞因子的分泌。体内结果显示,EV71感染的小鼠脑组织中星形胶质细胞增多,并且星形胶质细胞中p38MAPK信号明显激活。结论星形胶质细胞C5a/C5aR通路介导p38 MAPK信号促进EV71感染所致的神经系统损伤;C5a/C5aR通路拮抗剂PMX53对EV71感染引起的中枢神经系统的损伤具有保护作用。