转基因bkt和CrtR-B启动草莓生物合成虾青素的研究

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虾青素(astaxanthin)是一种氧化性酮式类胡萝卜素,最新的生理学和药理学研究发现,它具有很强的生物抗氧化活性,被称为“超级维生素E”。虾青素可以解除光诱导产生的氧化胁迫,有很强的抑制光敏作用的能力,可以提高生物体光能的利用率,提高作物的产量;此外虾青素还具有促进抗体产生、抗紫外线辐射、增强免疫力、抗癌症以及防止皮肤衰老、维护中枢神经系统和眼睛健康等多种生理功能。草莓(Fragaria×ananassa Duch.),享有“水果皇后”之美誉,是一种蔷薇科草莓属多年生草本植物。草莓是一种经济价值较高的水果,它的世界产量居小浆果之首,其果实柔软多汁,富含极丰富的糖、酸、矿物质、维生素C和蛋白质、无机盐等。如果能在草莓中合成虾青素,则可能在一定程度上增强植株各组织的抗光氧化能力,提高生物体光能利用率,提高作物产量,改善草莓的品质,对进一步提高草莓的营养价值有重要的意义。  β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)是虾青素合成过程中的关键酶,本研究将 bkt和CrtR- B这两个基因构建到同一植物表达载体上,以获得pCAMBIA1301-bkt-CrtR-B双价植物表达载体,并转化农杆菌菌株EHA105,由其介导转化草莓品种‘甜查理’(‘Sweet Charlie’),以获得转基因植株,有望通过调控代谢途径在草莓中合成虾青素。具体研究结果如下:  1.建立了草莓品种“丰香”(‘Toyonoka’)、“章姬”(‘Tochiotome’)、“甜查理”(‘Sweet Charlie’)和“红颜”(‘Benihoppe’)的组培快繁体系。结果表明:不同基因型草莓品种的组培快繁体系存在差异。不同品种的草莓品种最佳的增值培养基不同,甜查理的最佳增值培养基为MS+6-BA0.3 mg/L+NAA0.5 mg/L;章姬的最佳的增值培养基为MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.1 mg/L;红颜的最佳的增值培养基为 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.1 mg/L;丰香的最佳的增值培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。不同基因型的草莓生根所需要的激素浓度不同,对于章姬和丰香品种,最佳生根培养基为1/2 MS+IBA0.5 mg/L;红颜为1/2 MS+IBA0.8 mg/L;甜查理的最适生根组合为1/2 MS+IBA0.1 mg/L。  2.研究了影响遗传转化的主要因素,激素的种类和浓度、抗生素筛选等对草莓品种“甜查理”(‘Sweet Charlie’)和“红颜”(‘Benihoppe’)叶片再生的影响,同时研究了抗生素潮霉素(Hm)及头孢霉素(Cef)对组培苗增值和生根的影响,为后面工程菌介导的草莓遗传转化奠定基础。结果表明:无论对于红颜或是甜查理,TDZ的浓度组合比6-BA的浓度组合更有利于叶片的离体再生。对于红颜叶片再生,最佳生长调节剂组合为MS+TDZ2.0 mg/L+IAA0.1 mg/L,甜查理的最佳生长调节剂组合为MS+TDZ3.0 mg/L+IBA0.1 mg/L。对于红颜和甜查理这两个品种,叶片再生和继代苗的选择上宜选用潮霉素的浓度为4 mg/L作为选择压,而在生根上用潮霉素3 mg/L作为选择压。在叶再生时可以将头孢霉素为400 mg/L作为抑菌浓度,在继代苗生根过程中可以将头孢霉素为200 mg/L作为抑菌浓度。  3.构建了植物表达载体pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。用bkt基因替换PBI121中的GUS基因形成含有CaMV35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后将表达盒插入植物表达载体 pCAMBIA1301中获得植物表达载体 p1301-bkt;再用crtR-B基因替换p1301-bkt中的GUS基因,获得植物双价表达载体pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。并将其转化根癌农杆菌菌株EHA105,获得工程菌EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B。  4.以草莓品种“甜查理”(‘Sweet Charlie’)组培苗叶片为受体,用工程菌EHA105/pCAMBIA1301-bkt-crtR-B介导进行草莓遗传转化,经提取转化草莓植株的DNA进行PCR检测,初步证明bkt和crtR-B均整合到草莓基因组中。
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