二甲双胍(Metformin)为治疗Ⅱ型糖尿病的一线药物,近年来其在治疗多囊卵巢综合症、抑制肿瘤以及抗衰老方面的作用也越来越受到关注。二甲双胍被认为是一种胰岛素增敏剂,可以通过降低胰岛素和胰岛素结合蛋白水平来间接降低IGF-1表达水平,进而通过这一机制产生抗肿瘤增殖效应。巨噬细胞(Macrophages)是一种位于组织内的白细胞,源自单核细胞,而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。癌细胞会通过给予巨噬细胞集落刺激因子CSF1和CD47蛋白的方式“收买”巨噬细胞,以使其协助肿瘤血管生成和转移,以及产生耐药性,甚至吞噬PD-1抗体,保护癌细胞。二甲双胍已经被明确证实具有抗肿瘤作用,同时巨噬细胞与癌细胞又有着密不可分的关系,然而二甲双胍对巨噬细胞增殖的影响以及其中的分子机制仍然不清楚。本研究以鸡巨噬细胞HD11为模型,用不同浓度二甲双胍处理后,观察其增殖及凋亡情况。同时采用RNA-seq和生物信息学方法来分析鉴定差异表达的mRNA及有关信号通路。最后对筛选出的基因构建过表达载体来研究其功能,以探究二甲双胍对巨噬细胞的作用机制。主要的研究方法与结果如下:1、不同浓度二甲双胍处理对鸡巨噬细胞增殖和凋亡的影响用1mM、5mM和25mM二甲双胍处理HD11细胞,并设置空白对照,然后使用MTT实验检测不同浓度二甲双胍处理对HD11细胞增殖的影响,结果显示,1 mM二甲双胍即可抑制细胞的增殖,并且抑制程度随着浓度的提高而加深;随后使用流式细胞术检测药物处理是否可以诱导细胞的凋亡,结果显示1 mM二甲双胍可以显著提高HD11细胞的凋亡率(P<0.05),而5mM二甲双胍可以极显著诱导细胞凋亡(P<0.01);为了确认流式细胞术结果,进行了 DNALadder实验,发现随着药物浓度的提高,小片段DNA条带更加明显,说明细胞基因组断裂程度逐渐提高。2、二甲双胍处理对鸡巨噬细胞基因表达谱的影响为研究二甲双胍处理对鸡巨噬细胞基因表达谱的影响,对药物处理HD11细胞和对照组细胞进行了转录组测序。结果发现二甲双胍处理前后总共有1315个差异表达的基因,其中,有576个基因上调,739个基因下调。GO分析发现差异基因主要富集于脂质稳态、细胞发育过程、炎症反应、趋化因子活性和肽酶活性等生物学过程和分子功能GO类别。KEGG分析结果显示差异基因主要富集在ECM-受体相互作用、MAPK信号通路、类固醇生物合成和钙信号通路等通路。GESA富集分析发现差异基因中与细胞凋亡密切相关的G0s2基因显著富集,是二甲双胍作用过程中的关键基因,因此选此基因进行下一步研究。为了验证转录组测序结果的正确性,从差异基因中选择了 5个,上调的基因:G0s2、Ccl5、Ggcl1、Il-1β和Il-8和5个下调的基因:Bcl2、Fgf8、Fos、Apoa5和Serpinf1进行RT-qPCR验证,其结果与转录组测序结果一致,说明测序结果可信。3、过表达G0s2基因对鸡巨噬细胞凋亡和Myc蛋白表达的影响为了研究二甲双胍是否通过G0s2基因发挥作用,首先根据G0s2基因CDS区序列构建过表达载体pcDNA3.1-G0S2,将载体测序数据与NCBI数据库比对无误后,提取质粒。利用Xfect转染试剂分别将2μg和5μg pcDNA3.1-G0S2瞬时转染至HD11细胞中,同时以转染pcDNA3.1-GFP细胞为对照,倒置显微镜观察细胞形态,使用流式细胞术测定过表达G0s2对细胞凋亡的影响。为进一步研究凋亡发生的机制,使用Western blot检测二甲双胍处理和G0s2过表达对Myc蛋白表达的影响。结果显示:与对照组相比,转染pcDNA3.1-G0S2后细胞不能维持正常形态,变成数个的凋亡小体;流式细胞术结果表明Gf0s2可以极显著诱导HD11细胞的凋亡(P<0.01);与对照组相比,5mM二甲双胍处理可使Myc蛋白表达极显著下调(P<0.01);与对照组相比,过表达G0s2可使Myc蛋白表达极显著下调(P<0.01)。这些结果说明二甲双胍可能通过G0s2表达的上调和Myc蛋白表达的下调发挥作用。总之,本研究发现二甲双胍可以改变大量基因的表达,可能通过改变G0s2、Myc蛋白表达等途径抑制巨噬细胞增殖和诱导其凋亡,这些结果对后续研究二甲双胍作用机制特别是抗肿瘤机制具有一定的意义。