论文部分内容阅读
毛细管电泳(CE)是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术,具有分离速度快、分离效率高、分析成本低、试剂用量少、环境友好等特点,实现了分析分离技术从微升级进入到了纳升级水平,并使得单细胞分析和单分子分析成为了可能,为分离和分析蛋白质等生物大分子提供了新的途径。化学发光(CL)是化学反应过程中伴有的一种光辐射现象。基于化学发光体系中待测物浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,该方法可用于分析能够直接产生化学发光或影响化学发光信号的物质。化学发光法由于不需要激发光和外加光源,因此避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音的影响,是一种高灵敏和简便的痕量分析方法。将毛细管电泳技术与化学发光法检测联用可结合二者的优势,在物质分离分析方面具有很大的应用前景,是一种非常理想的检测手段。近年来,两种技术的联用已在医药检测、临床检测、环境检测、法医毒物检测以及微量物证分析等多个领域有广泛应用。Ag(Ⅲ)配合物[Ag(HIO6)2]5--鲁米诺是一种新型的化学发光体系,在碱性介质中,二者发生氧化还原反应,产生化学发光信号。某些物质对该化学发光信号可产生增强或抑制作用,并且在一定物质浓度范围内,对化学发光信号的增强或抑制作用与物质浓度呈现良好线性关系。根据这一原理,本研究将Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光新体系与毛细管电泳分离技术联用,建立了毛细管电泳-化学发光法检测尿液与血液中吗啡含量和毛细管电泳-化学发光法同时检测尿液中肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇(MHPG)、3-甲氧基-4-羟基-苦杏仁酸(香草扁桃酸,VMA)、3-甲氧基-4-羟基乙酸(高香草酸,HVA)的新方法。新方法操作简单、分离效率高、分析时间短、试剂消耗少、对环境友好。第一部分毛细管电泳-化学发光法检测尿液与血液中吗啡含量目的:将Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光新体系与毛细管电泳分离技术联用,建立毛细管电泳-化学发光法检测尿液与血液中吗啡含量的新方法,并成功应用于尿液和血液中吗啡的定性与定量分析。方法:对实验条件进行优化,最佳实验条件为:Ag(Ⅲ)配合物浓度为7.0×10-55 mol/L(其中Ag(Ⅲ)配合物中NaOH浓度为0.04 mol/L、Na2CO3浓度为0.008 mol/L)、鲁米诺浓度2 mmol/L、硼砂浓度5 mmol/L、分离电压15 kV、进样时间12s。采用HLB(200 mg,6cc)固相萃取小柱对尿样和血样进行净化和浓缩,氮气吹干后复溶,在优化的条件下对样品进行检测。在高压直流电场作用下,吗啡与生物样品中其它物质在毛细管中实现分离,到达检测窗口后,与Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光体系作用,影响体系的氧化还原反应,从而影响化学发光信号的大小。基于碱性介质中,吗啡对该反应的化学发光信号起抑制作用,且在一定浓度范围内,抑制作用与吗啡浓度呈现良好线性关系,据此建立标准曲线,测出吗啡含量。结果:最佳检测条件下,方法检出限为0.75μg/mL,在吗啡浓度为230μg/mL浓度范围内线性关系良好,回归方程为ΔI=3.8265c+14.14(R2=0.9998)。取20μg/mL吗啡进行7次平行实验,测得相对标准偏差(RSD)为2.01%。尿液和血液中样品平均加标回收率分别为109.03%和101.28%。结论:建立了毛细管电泳-化学发光法检测尿液与血液中吗啡含量的新方法,并成功用于尿样与血样中吗啡含量的检测。该方法操作简便、分离效果好、样品消耗量少、分析成本低廉、对环境友好,结果令人满意。第二部分毛细管电泳-化学发光法同时检测尿液中肾上腺素、去甲肾上腺素及其代谢产物含量目的:将Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光新体系与毛细管电泳分离技术联用,建立毛细管电泳-Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光法同时检测尿液中肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇(MHPG)、3-甲氧基-4-羟基-苦杏仁酸(香草扁桃酸,VMA)、3-甲氧基-4-羟基乙酸(高香草酸,HVA)的新方法,并成功应用于尿液中E、NE、MHPG、VMA和HVA五种物质含量的同时测定。方法:尿样经强酸性阳离子交换树脂和超高速低温离心处理后,经0.22μm滤膜过滤后直接进样检测。在优化的实验条件,即Ag(Ⅲ)配合物浓度为2.0×10-4 mol/L、NaOH浓度为0.05 mol/L、Na2CO3浓度为0.04mol/L、鲁米诺浓度为3 mmol/L、硼砂浓度为5 mmol/L、胆酸钠浓度为3mmol/L、分离电压为15 kV、进样时间为15 s,对样品进行分离检测。五种分析物经毛细管电泳分离后,与Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光体系作用,均能影响发光体系的发光信号。其中,肾上腺素对化学发光起增强作用,去甲肾上腺素、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇、香草扁桃酸、高香草酸均对化学发光起抑制作用。且在一定物质浓度范围内,增强或抑制作用与物质浓度呈现良好线性关系,据此建立各物质标准曲线,测出各待测物质含量。结果:在优化的检测条件下,肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇、香草扁桃酸、高香草酸的线性方程分别为:ΔI=5.8429c+10.833,R2=0.9983;ΔI=5.8534c+52.882;R2=0.9984;ΔI=13.234c+84.315,R2=0.9986;ΔI=2.3409c+19.318,R2=0.9999;ΔI=9.9333c+9.906,R2=0.9994。线性范围分别为:212μg/mL、230μg/mL、220μg/mL、260μg/mL、220μg/mL。对样品进行平行进样7次,得到相对标准偏差分别为:4.50%、4.97%、3.23%、3.36%、3.07%。肾上腺素、去甲肾上腺素、高香草酸三种物质的检出限均为0.50μg/mL、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇检出限为0.10μg/mL、香草扁桃酸检出限为0.75μg/mL;五种待测物质的平均加标回收率分别为103.96%、101.76%、100.65%、106.48%、102.87%。结论:建立了毛细管电泳-Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光法同时检测尿液中肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基-4-羟基-苯乙二醇、香草扁桃酸、高香草酸的新方法。同时对样品前处理条件进行考察,简化了样品前处理过程。新方法简便灵敏、分析成本低、样品消耗少,结果令人满意。