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喜温嗜酸硫杆菌(At.caldus SM-1)是一种重要的生物冶金微生物，在生物冶金工业上具有非常广泛的应用。但是At.caldus SM-1在实际应用过程中，因为菌体生长缓慢、细胞得率低以及对冶金环境适应性差等缺点的存在，严重限制了其应用范围，要想充分发挥At.caldus SM-1在生物冶金过程中的作用，对At.caldus SM-1进行遗传改造势在必行，这就需要构建一个高效的遗传操作系统。 本研究工作主要集中于At.caldus SM-1的遗传操作系统的构建，进行了以下三部分工作:1）对At.caldus SM-1中提取的质粒pLAtc1进行生物信息学分析并通过实验验证了质粒pLAtc1具有IncQ-like广泛宿主质粒的性质，适合构建遗传操作系统。生物信息学分析发现质粒pLAtc1骨架含有一个复制区（包含一个oriV，三个rep基因），一个接合区（包含五个mob基因，一个Nic位点）和一个质粒成瘾系统基因，通过对比分析发现质粒pLAtc1的骨架结构与已经发现的IncQ-like广泛宿主质粒具有很大的相似性，特别是通过MSLA方法对质粒pLAtc1的骨架基因(oriV、 repA、repB、repC、mobA、mobB、mobC)分析发现，质粒pLAtc1与IncQ-like广泛宿主质粒(pTF-FC2，pTC-F14 and pRAS3)的同源性要比与IncQ广泛宿主质粒的同源性高，所以，推断质粒pLAtc1可能属于IncQ-like广泛宿主质粒中新的一员。本研究在pLAtc1的基础上引入卡那霉素抗性基因（Kmr）构建了质粒pLAtc-Km，并对质粒pLAtc-Km的Ⅰ型限制性位点进行了点突变，通过实验发现质粒pLAtc-Km除能在At.caldus SM-1中进行复制外，还能够在E.coli，C.testosteroni中复制，说明质粒pLAtc1具有广泛的宿主能力;质粒pLAtc-Km具有高的接合频率，以E.coli S17-1为供体，E coli BL21为受体，接合频率为12.7±1.1，以E coli S17-1为供体，At.caldus SM-1为受体，接合频率为1.50±0.80×10-3;通过QPCR测定质粒pLAtc1在At.caldus中的拷贝数为7，pLAtc1-Km在E coli中的拷贝数为4;质粒pLAtc1-Km在Ecoli DH5α中具有高的稳定性，繁殖150代后稳定性仍达100％。2）本研究构建了表达载体pLAtcE，表达载体pLAtcE是在质粒pLAtc1的基础上引入了连四硫酸钾水解酶基因的启动子(PtetH)，多酶切克隆位点序列(MCS)，转录终止序列，卡那霉素抗性基因(Kmr)，具有链霉素抗性(Smr)的aadA基因构建的。本研究构建了表达载体pLAtcE-egfp，pLAtcE-egfp在E coli SM10和At.caldus SM-1中表达后均能检测到绿色荧光，绿色荧光蛋白的表达证实了pLAtcE的接合能力以及pLAtcE在E.coli SM10和At.caldus SM-1中的表达能力。本研究构建了表达载体pLAtcE-sucA-sucB-sdhA，并测得了pLAtcE-sucA-sucB-sdhA表达的α-酮戊二酸脱氢酶以及琥珀酸脱氢酶的酶活，结果发现pLAtcE-sucA-sucB-sdhA的表达对At.caldus SM-1细胞的生长，产酸，氧化能力均有一定的促进作用。3）本研究成功构建了3个人工修饰质粒pET28a-SM1、pET28a-SM2、pET28a-SM1M2并成功的对要进行接合的质粒进行了修饰，修饰后的质粒pLAtc1-Km的接合频率分别为9.24±2.0×10-4，7.50±3.25×10-4，1.92±0.98×10-3，人工修饰质粒的修饰作用使质粒pLAtc1-Km成功越过了At.caldus SM-1的Ⅰ型限制性屏障，实现了对At.caldus SM-1的遗传操作。