【摘 要】
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目的:以半夏白术天麻汤为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术,构建了miR-217基因敲除的小鼠并进行基因组测序,观察基因敲除后的生理指标和行为学变化。通过对比观察半夏白术天麻汤灌胃高脂饮食诱导的痰湿壅盛型高血压小鼠和miR-217基因敲除小鼠,探讨半夏白术天麻汤化痰祛湿的药理机制,进一步明确半夏白术天麻汤通过激活miR-217抑制JAK2/STAT3信号通路的过程。方法:利用CRISPR/C
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目的:以半夏白术天麻汤为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术,构建了miR-217基因敲除的小鼠并进行基因组测序,观察基因敲除后的生理指标和行为学变化。通过对比观察半夏白术天麻汤灌胃高脂饮食诱导的痰湿壅盛型高血压小鼠和miR-217基因敲除小鼠,探讨半夏白术天麻汤化痰祛湿的药理机制,进一步明确半夏白术天麻汤通过激活miR-217抑制JAK2/STAT3信号通路的过程。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建miR-217基因敲除小鼠,并通过转录组测序评价miR-217敲除对小鼠主动脉的在体影响;PCR法断尾鉴定小鼠基因型;对miR-217基因敲除小鼠和C57BL/6J野生型小鼠进行行为学实验:糖水实验、水迷宫实验、转棒跑步实验;通过液相色谱/电喷雾质谱（LC/ESI/MS）对miR-217基因敲除小鼠和野生型小鼠的脑中神经递质水平进行检测;而后取16只miR-217基因敲除小鼠和16只C57BL/6J小鼠喂养高脂饲料12周诱导痰湿壅盛型高血压小鼠模型,随机分为药物组（miR-217-/-+HFD+半夏白术天麻汤（BBTD））、HFD（（高脂饲料诱导）+BBTD）和模型组（miR-217-/-+HFD、HFD）,药物组灌胃半夏白术天麻汤8周,以喂普通饲料的8只C57BL/6J小鼠为正常对照组（NC）（n=8）。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中IL-1β（白细胞介素1β）、IL-6（白细胞介素-6）、TNF-α（肿瘤坏死因子α）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）炎症水平;免疫组化染色观察主动脉IL-6ST（白细胞介素6信号转导因子）、Irak1（白细胞介素-1受体相关激酶）、Sirt1（沉默信息调节因子1）分布情况;HE染色观察主动脉形态,观察脑、胰腺、肝脏组织的病理情况;蛋白免疫印记法（Western Blot）测定主动脉的JAK2/STAT3、NF-κB p65信号通路中关键蛋白的表达水平。结果:成功构建miR-217小鼠模型;miR-217敲除纯合子小鼠体重较野生型增加了 20-30%;转棒跑步实验中跑步时间相比于野生型小鼠显著降低,提示小鼠出现严重的运动协调异常。血压正常;糖水偏好率、Morris水迷宫实验无统计学差异;神经递质水平显示miR-217基因敲除小鼠脑中乙酰胆碱、3-甲氧基酪胺、酪胺、血清素、谷氨酸大幅度下降（依次下降了 53.67%、89.13%、50.05%、27.85%、17.29%）,肾上腺素升高了16.4%;转录组测序结果提示,miR-217敲除后,小鼠主动脉出现166个mRNA表达上调,86个mRNA表达下调（fold change＞2.0,P＜0.05）;高脂饲料饲养小鼠12周后成功建立痰湿壅盛型高血压小鼠模型,半夏白术天麻汤给药8周后,小鼠的状态有不同程度的改善,血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1下降;主动脉炎症状态减轻（IL-6ST、Irak1分布减少）、衰老程度改善（Sirt1增加）;主动脉HE染色显示改善了血管平滑肌层增生肥大;脑、胰腺、肝脏组织病理均有不同程度的改善;主动脉中JAK2/STAT3通路的活性受到抑制,其药物作用因miR-217敲除而显著降低。但半夏白术天麻汤药效并未因miR-217敲除而完全阻断,并表现出一定的“多靶点效应”。结果证实半夏白术天麻汤靶向激活miR-217抑制JAK2/STAT3信号通路,发挥祛痰利湿作用。结论:miR-217及其下游基因是半夏白术天麻汤体内的主要作用靶点之一。
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