目的：中枢神经系统再生困难是由于神经再生的不利环境因素,以及通常认为神经细胞不能进行再分裂和增殖的终末分化细胞。神经干细胞可以自我更新及复制分裂,被认为能够替换与治疗多种神经系统疾病,它们的一系列潜在价值在最近才被发现,神经干细胞具有高度的迁移性并能够被吸引并移至病变大脑侧如缺血或肿瘤的病变部位,从而它成为非常有治疗前景的工具。本研究拟采用逆转录病毒将携带Cre-LoxP系统的SV40-T基因外源性导入胚胎小鼠神经干细胞制备永生化胚胎神经干/祖细胞系。使用神经干/祖细胞特异性标记物鉴定永生化神经祖细胞的干/祖细胞表型,及具有多向分化潜能的可能性。另外,实验拟证明使用Cre重组酶敲除SV40-T基因可逆转永生化神经干细胞增殖特性,使其成为原代细胞从而具有向不同神经细胞分化的能力。同时运用在体研究证实永生化的神经干细胞有别于肿瘤细胞,不具有侵袭性。进一步证实其具有广泛的临床及科研利用价值,为中枢神经系统再生和功能恢复提供了新的手段。方法：第一部分：孕12.5天和14天CD1小鼠各1只,从孕鼠子宫中取出12.5天及14天胚胎。解剖显微镜下分离胎鼠端脑组织,胰酶消化为单细胞悬液,采用神经球培养法培养神经干细胞。神经球培养3天后,将神经干细胞机械分离为单细胞贴壁培养,同时使用含有SV40T抗原的表达质粒SSR#69及pCL-Ampho逆转录骨架质粒同时转染HEK293细胞。293细胞合成携带SV40T抗原基因的逆转录病毒分泌于培养基,将逆转录病毒培养基感染贴壁神经祖细胞,经潮霉素B抗生素加压筛选,获得阳性克隆即永生化神经祖细胞后扩增培养。第二部分：永生化神经祖细胞(iNPC)传至数代后进行特性鉴定。使用RT-PCR评估iNPC的自我更新能力以及神经细胞特异性,并对其代表不同脑区神经祖细胞进行鉴定,以及使用免疫荧光染色进一步鉴定分化成为不同成熟神经细胞的潜力。使用Ad-Cre重组腺病毒感染iNPC使SV40T特异性敲除获得逆永生化神经祖细胞NPC,设立Ad-GFP腺病毒感染iNPC组作为对照组,通过台盼蓝染色法、MTT试验、结晶紫染色及细胞周期分析,评估iNPC与NPC的增殖能力。用体外诱导iNPC与NPC向成熟神经细胞分化条件,使用RT-PCR.免疫荧光染色对iNPC与NPC向成熟神经细胞分化进行鉴定。最后对iNPC的膜电位进行功能分析,以及在体移植iNPC与NPC对其体内增殖能力进行评估。结果：第一部分：成功取得E12.5天及E14胚胎神经干细胞,通过神经球培养神经干细胞方法获得大量神经球形成及增殖,神经球经过机械分离为单个神经干细胞能够贴壁生长。使用逆转录病毒整合SV40T基因到胚胎神经祖细胞基因组中成功获得永生化神经祖细胞系,在传代过程中细胞具有不断增殖及分裂能力。第二部分：通过RT-PCR证明永生化的细胞系为神经祖细胞,并且为特异的中枢神经系统来源细胞。iNPC能代表前脑、中脑、腹侧大脑等区域。并且iNPC具有向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化的潜能。免疫荧光染色证实iNPC广泛表达nestin及beta3-tubulin等神经祖细胞标记物。Ad-Cre及Ad-GFP感染iNPC后,Ad-Cre组iNPC细胞形态逐渐向原代细胞改变,而Ad-GFP组细胞保持原有形态。细胞增殖试验发现Ad-GFP具有明显增殖能力,而Ad-Cre组在培养过程中倾向于不增殖甚至死亡,提示Cre重组酶将SV40T从iNPC中敲除。细胞周期试验发现Ad-GFP组细胞主要处于G2期,而Ad-Cre组细胞主要停留在G1期。免疫荧光染色发现iNPC逆转永生化后呈现出部分MAP2、GFAP及04阳性细胞,提示其多向分化能力。细胞膜电位分析发现iNPC能够诱发出较幼稚的动作电位。体内移植iNPC及NPC发现细胞在异位组织不能增殖。结论：本研究成功建立永生化神经祖细胞系iNPC,实验证明其在体外无限增殖的可能性并不受限于培养条件。证明永生化神经祖细胞能够代表不同脑区,并具有多向分化潜能。永生化具有可逆性,iNPC在一定条件下可逆转成为原代细胞,改变其增殖特性。同时应用在体研究证实iNPC不具有侵袭性,有别于肿瘤细胞。iNPC的成功建立具有广泛的临床及科研应用价值。