流感病毒NP蛋白乙酰化修饰在病毒复制中的作用机制

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A型流感病毒能引起全球大流行,致上千万人死亡,是威胁人类健康的重要病原。由于A型流感病毒变异性高、宿主范围广、传播途径多样,流感防控形势非常严峻。流感疫苗和抗病毒药物是抗击流感的主要措施,目前广泛使用的抗流感药物是病毒神经氨酸酶NA抑制剂(奥司他韦、达菲)和病毒离子通道M2抑制剂(金刚烷胺、金刚乙胺)。当前很多A型流感毒株对金刚烷胺和金刚乙胺具有抗药性,而对奥司他韦耐药的毒株也不断涌现,寻找抗病毒药物新靶点迫在眉睫。一些宿主蛋白能抑制流感病毒复制,识别这些蛋白并阐明其机理能为抗病毒药物研发提供理论基础。乙酰化修饰是一种可逆的表观遗传修饰,在染色质重塑、RNA剪切、基因表达、蛋白转运和细胞周期中具有重要作用。去乙酰化酶HDACs在HSV、HBV、HIV、HPV等病毒复制和致病中扮演重要角色,而其在流感病毒复制中的作用还未阐明。NP蛋白是流感病毒的主要结构蛋白,也是宿主细胞与病毒相互作用的连接器。NP蛋白受到磷酸化、泛素化、SUMO化和ISG修饰,而NP蛋白是否受到乙酰化修饰、NP蛋白的乙酰化位点以及NP蛋白乙酰化在病毒复制中的作用还未见报道。  本研究对NP蛋白的乙酰化进行综合分析。通过质谱分析,检测NP蛋白具有6个乙酰化位点:K91、K103、K198、K227、K229和K470。K103位点突变时,NP蛋白的乙酰化水平下降最明显。双荧光报告基因检测发现K103突变为R、A和H时,RNPs聚合酶活性增强;K91R和K198R的RNPs聚合酶活性显著降低;K227R、K229R和K470R的RNPs聚合酶活性分别是野生型的1.4、1.5和1.9倍。通过反向遗传学拯救K103位点突变的病毒rK103A和rK103R。与NP rWT相比,rK103A和rK103R在细胞中复制能力增强。K91R和K198R不能拯救出病毒,K227R重组病毒的毒力与WT类似,K229R复制能力降低,而K470R重组病毒复制能力显著增强。  HDAC ClassⅠ家族在流感病毒复制中具有重要作用,免疫共沉淀结果表明,NP蛋白与HDAC1有互作,与HDAC2、HDAC3和HDAC8没有互作。NP蛋白与HDAC1在细胞核中共定位,NP蛋白的body domain是与HDAC1互作的主要结构域。HDAC1降低了NP蛋白的乙酰化水平。我们通过低表达HDAC1研究其在流感病毒中的作用。在A549细胞中转染siHDAC1,NP蛋白在细胞核中的分布减少,RNPs聚合酶活性降低。通过慢病毒介导的shRNA在A549细胞中建立HDAC1低表达的稳转细胞株,低表达HDAC1抑制流感病毒rWT、rK103A和rK103R的释放。进一步研究表明沉默HDAC1通过激活TBK1-IRF3和ERK信号通路抑制病毒的复制。流感病毒入侵细胞时HDAC1mRNA和蛋白的表达水平都降低,而HDAC1表达降低通过激活Ⅰ型干扰素信号通路抑制流感病毒的复制。  综上表明,NP蛋白受到乙酰化修饰,K103是一个主要位点,K103突变增强病毒在细胞中的复制能力。NP蛋白与HDAC1有互作,低表达HDAC1抑制流感病毒的复制,揭示HDAC1可能是流感病毒药物研发的新靶点。
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