【摘 要】
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蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一类兼性需氧的革兰氏阳性菌,广泛分布于空气、土壤和污水中,炒米饭、牛奶和肉类制品等食品也是其主要污染对象,该菌可引起食物中毒,中毒症状主要表现为呕吐和腹泻,分别与呕吐毒素和肠毒素有关。呕吐毒素与肠毒素相比,在环境中具有良好的耐受性,主要存在于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌污染的食物中。因此,建立有效的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌检测方法,对于预防和监测因误食该菌污
【基金项目】
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南昌大学食品科学与技术国家重点实验室研究基金（SKLF-ZZA-201912）； 江西省主要学科学术带头人培养计划（20194BCJ22004）；
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蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一类兼性需氧的革兰氏阳性菌,广泛分布于空气、土壤和污水中,炒米饭、牛奶和肉类制品等食品也是其主要污染对象,该菌可引起食物中毒,中毒症状主要表现为呕吐和腹泻,分别与呕吐毒素和肠毒素有关。呕吐毒素与肠毒素相比,在环境中具有良好的耐受性,主要存在于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌污染的食物中。因此,建立有效的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌检测方法,对于预防和监测因误食该菌污染的食物导致的中毒事件具有重要意义。滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）是一种简单、高效的等温酶扩增技术,利用环状DNA模板和特殊的DNA聚合酶将短单链DNA（Single stranded DNA,ss DNA）引物扩增为长链DNA分子,实现核酸信号放大。RCA因其反应恒温,设计简单、操作简便,并且可以结合不同的信号输出策略而被广泛应用。本研究基于RCA核酸信号放大技术,结合“阻断剂”加尾的聚合酶链式反应（Blocker-tailed polymerase chain reaction,Bt-PCR）、适配体（Aptamer,Apt）和指数型线性滚环扩增（Exponential-linear RCA,ELRCA）技术建立荧光传感器检测牛奶加标样中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌,各章内容分述如下:第一章:介绍了G-四链体和RCA技术的基本原理,综述了基于G-四链体和RCA放大策略在生物传感器中的应用研究进展。第二章:建立了Bt-PCR-RCA荧光传感器用于牛奶加标样中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测,首先以产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的特异性基因ces B作为目的基因,设计“阻断剂”加尾引物,进行PCR扩增后得到的Bt-PCR产物以linker DNA作为“桥梁”,与哑铃DNA模板进行结合引发RCA反应,得到大量重复的富含G-四链体（G-quadruplex）序列的产物,荧光染料硫黄素T（Thioflavin T,Th T）与G-四链体结构的结合产生荧光信号,通过测定荧光信号,实现对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测。在最优条件下,该荧光传感器对纯菌液中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测限（limit of detection,LOD）达到10 CFU/m L以下,对牛奶加标样中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的LOD达到10 CFU/m L以下,且该方法表现出较好的特异性。第三章:建立了Apt-RCA荧光传感器检测牛奶加标样中的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。该荧光传感器通过构建DNA功能化磁珠,利用适配体和目标菌之间的亲和力使得适配体互补DNA链（complementary DNA,c DNA）被竞争下来,借助磁分离技术,游离于上清液中的c DNA链与环状模板的结合引发RCA反应,得到的RCA产物富含大量的G-四链体序列,荧光染料Th T与G-四链体结构的结合产生明显的荧光信号,从而实现对样品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的荧光检测。利用琼脂糖凝胶电泳和测定荧光强度验证了方法的可行性,并优化了磁珠孵育时间、RCA环状模板用量以及RCA反应时间等重要实验参数,并测定了Apt-RCA荧光传感器LOD及特异性。在最优条件下,该方法对纯菌液中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的LOD为1.4×10~2CFU/m L,对牛奶加标样中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的LOD为2.2×10~3CFU/m L。该荧光传感器所需检测时间短、操作简便且特异性较好。第四章:建立了Apt-ELRCA荧光传感器检测牛奶加标样中的产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。利用已构建好的DNA功能化的磁珠,目标菌与适配体特异性结合,竞争出互补链c DNA,经磁分离后,游离于上清液中的c DNA以环状DNA为模板进行ELRCA反应,实现了包含G-四链体短链的指数型放大和积累,荧光染料Th T与G-四链体结构的结合产生荧光信号,实现对产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的检测。利用琼脂糖凝胶电泳和荧光检测验证了方法的可行性,并优化了环状DNA模板的用量、第二引物浓度以及ELRCA反应时间等重要实验参数,并测定了该方法的LOD及特异性。在最优条件下,该荧光传感器在纯菌液中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的LOD为3.6×10~1CFU/m L,在牛奶加标样中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的LOD为3.0×10~2CFU/m L,且具有较好的特异性。综上所述,本研究基于G-四链体和RCA信号放大技术结合PCR及适配体构建荧光生物传感器,用于实现牛奶中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌灵敏特异的检测,所建立的荧光传感器具有较好的灵敏度和特异性,且较为简便,为我国食源性致病菌的快速筛查提供新的技术参考。
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