几丁质酶3样蛋白1（Chitinase 3 like protein 1,CHI3L1）是糖基水解酶蛋白18家族中的一员,广泛存在于真核及原核生物中,能结合几丁质,但缺乏剪切活性。CHI3L1可以由中性粒细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等表达分泌。CHI3L1是重要的固有免疫和获得性免疫调节分子,研究表明CHI3L1在炎症小体的激活、细胞凋亡、巨噬细胞分化、Th1/Th2细胞平衡以及组织损伤和修复中发挥重要的作用,其已被证实在大量的炎症性疾病及肿瘤中表达升高,如酒精性肝病、动脉粥样硬化、胃癌、乳腺癌及脑胶质瘤等。因此,探究CHI3L1在炎症性疾病及肿瘤中的作用和及其靶向的信号通路,具有重要的临床意义。第一部分CHI3L1通过负调控TGF-β信号通路抑制肝纤维化进展背景和目的:肝纤维化是由病毒、酗酒、寄生虫以及自身免疫性疾病等多种因素导致的肝脏慢性损伤、炎症及修复过程,若损伤因素持续存在,则进一步进展为肝硬化、肝癌,进而引起肝功能失代偿。据统计,在不治疗的情况下,慢性活动性肝炎5年以上的患者发展为肝纤维化的几率为10~20%,每年有2~5%的患者最终进展为肝癌。有报道证实CHI3L1在酒精性肝病及肝硬化的患者血清中水平升高,但是其在慢性肝病中的作用及涉及到的分子机制仍待进一步的研究。本研究旨在探究CHI3L1与肝纤维化进展之间的相关性,研究CHI3L1在肝纤维化发展过程中的作用以及分子机制,为诊断和治疗肝纤维化提供理论依据。方法:分析GEO数据库中肝硬化转录组数据,探究肝脏中CHI3L1在m RNA水平的变化;收集南京医科大学第二附属医院消化医学中心确诊的肝硬化患者及门诊健康体检患者的血清,通过酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA）检测肝硬化患者血清CHI3L1的水平;通过肝脏组织芯片免疫组化,检测纤维化肝脏CHI3L1的蛋白水平,分析CHI3L1的表达与肝脏纤维化之间的相关性。体内实验中,我们采用腹腔注射硫代乙酰胺（Thioacetamide,TAA）的方法构建WT和Chil1-/-小鼠肝硬化模型,以肝脏羟脯氨酸的含量反映小鼠肝纤维化程度,Western blot检测肝脏ɑ-SMA及胶原（Collagen-?和Collagen-Ш）的表达,流式细胞术检测肝脏浸润的免疫细胞比例,肝脏转录组测序比较WT和Chil1-/-小鼠在m RNA水平分子表达的差异和涉及的信号通路的改变,探究CHI3L1在肝纤维化进展中的作用及可能靶向的信号通路。体外实验中,首先我们以TGF-β和重组CHI3L1联合处理人源性肝星状细胞株LX-2细胞,检测p-Smad2/3和Smad7的表达,探究CHI3L1对TGF-β信号通路的影响。然后,我们通过LX-2细胞膜蛋白Western blot和免疫荧光实验,探究重组CHI3L1对Smad7细胞膜募集的影响,从而评估CHI3L1在TGF-β信号通路级联激活过程中的作用。体内治疗实验中,我们在TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中,通过小鼠尾静脉注射重组CHI3L1,检测小鼠肝脏羟脯氨酸的含量评价小鼠肝硬化程度,Western blot检测ɑ-SMA、胶原、p-Smad2/3和Smad7的表达,评估重组CHI3L1对小鼠肝纤维化的防治效果。结果:在肝硬化患者和小鼠的血清及肝脏组织中,CHI3L1在m RNA和蛋白水平表达升高,且CHI3L1的水平与肝纤维化程度显著呈正相关,提示血清中CHI3L1可作为反映肝纤维化程度的生物靶标。体内实验中,TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中,Chil1-/-小鼠肝脏羟脯氨酸的含量较WT组小鼠升高,Western blot和免疫组化结果显示Chil1-/-组小鼠肝脏中ɑ-SMA及胶原表达高于WT组小鼠,表明Chil1-/-小鼠肝纤维化加重。肝脏转录组测序的GSVA（Gene set variation analysis,GSVA）显示,Chil1-/-小鼠肝脏TGF-β信号通路富集分数较WT组更高,提示CHI3L1靶向TGF-β信号通路抑制肝纤维化的进展。体外实验中,Western blot的结果显示重组CHI3L1预处理可以抑制Smad2/3的磷酸化,但Smad7的表达量没有改变。Western blot和免疫荧光显示CHI3L1能够促进Smad7向LX-2细胞的细胞膜募集,且免疫共沉淀结果显示CHI3L1与TGF-βR?直接相互作用,提示CHI3L1招募Smad7形成CHI3L1-TGF-βR?-Smad7复合体,抑制Smad2/3磷酸化,从而负调控TGF-β信号通路发挥抗纤维化作用。体内治疗实验中,给予重组CHI3L1治疗后WT和Chil1-/-小鼠均表现出肝脏羟脯氨酸含量、ɑ-SMA及胶原表达量的降低,Smad2/3的磷酸化减少,表明重组CHI3L1治疗可明显改善TAA诱导的小鼠肝硬化。结论:CHI3L1通过膜募集Smad7形成CHI3L1-TGF-βR?-Smad7复合体,抑制下游的Smad2/3磷酸化,负调控TGF-β信号通路,抑制TGF-β对肝星状细胞的激活,减轻肝脏纤维化的进展。第二部分CHI3L1靶向NF-κB信号通路及重塑肿瘤微环境促进胶质瘤进展背景和目的:脑胶质瘤是一组中枢神经系统肿瘤,占所有原发性脑肿瘤的80%。尽管目前手术治疗、放疗、化疗及免疫治疗广泛应用于临床上脑胶质瘤的治疗,然而高级别脑胶质瘤的5年生存率仅为15~35%。因此,探索调控脑胶质瘤发生发展的关键分子及其靶向的信号通路,是目前脑胶质瘤研究的首要目标和重要课题。有文献报道胶质瘤患者中表达升高的CHI3L1与患者的预后较差相关,且其表达水平与治疗过程中获得性耐药及放疗抵抗的产生密切相关。本课题旨在表征CHI3L1在胶质瘤中的表达,探究其在胶质瘤进展中的角色、作用及其靶向的信号通路,为脑胶质瘤的临床治疗提供理论基础。方法:首先,我们通过GEO和TCGA数据库转录组的差异分析,以及ELISA、IHC和Western blot检测胶质瘤患者血清和组织中CHI3L1的表达,从m RNA和蛋白水平探索CHI3L1与脑胶质瘤进展的相关性;采用Kaplan-Meier分析探讨CHI3L1表达与脑胶质瘤患者预后之间的相关性。然后,通过对GEO、TCGA和CGGA转录组分析进行GSEA和GSVA,探寻可能涉及的信号通路,分析CHI3L1的表达与信号通路富集之间的相关性;通过单细胞测序分析,在单细胞水平探寻引起信号通路富集的主要细胞亚群,分析CHI3L1在该细胞亚群中的表达与信号通路富集的相关性;体外实验中,通过缺陷/敲低CHI3L1后,进一步探讨CHI3L1的表达与信号通路激活之间的相关性。同时,对TCGA转录组数据进行免疫浸润分析,表征脑胶质瘤的免疫微景观,通过TIMER 2.0探究CHI3L1表达与免疫细胞浸润之间的相关性;在单细胞水平,通过GSEA探究CHI3L1表达对肿瘤微环境的重编程以及肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages,TAMs）分化的相关性;体外实验中,通过THP-1和BMDM诱导分化,研究CHI3L1对TAMs分化的影响。最后,通过平板克隆、Ed U增殖及划痕实验,研究CHI3L1对胶质瘤细胞株生长、增殖及迁移的影响。结果:在m RNA水平,基于GEO、TCGA的差异分析结果显示CHI3L1在胶质瘤中表达升高;在蛋白水平,ELISA、IHC和Western blot表明胶质瘤患者CHI3L1表达升高。Kaplan-Meier分析表明高表达CHI3L1的患者预后更差。GSE100675的GSEA显示NF-κB通路显著富集,TCGA和CGGA脑胶质瘤队列的GSVA显示CHI3L1的表达与NF-κB通路富集分数呈正相关;单细胞水平分析表明,在胶质瘤组织中,CHI3L1主要表达于肿瘤细胞,且CHI3L1high的肿瘤细胞NF-κB通路显著富集。体外实验中,在U87MG和A172细胞株中敲低CHI3L1,给予TNFɑ处理后NF-κB p65亚基的磷酸化受到明显的抑制。Co-IP实验证实CHI3L1与ACTN4结合,明CHI3L1结合ACTN4促进NF-κB核转录。TCGA的免疫浸润分析显示胶质瘤组织中TAMs浸润增多,且TIMER的分析表明CHI3L1的表达与TAMs浸润呈正相关;在单细胞水平,我们发现在肿瘤微环境的巨噬细胞中CHI3L1与CD44共表达。体外实验中,PCR结果显示Cd44-/-的BMDM给予IL-4处理后不能分化为M2表型的巨噬细胞,且Western blot显示Cd44-/-的BMDM AKT磷酸化受到抑制。最后,平板克隆、Ed U增殖及划痕实验均显示,在U87MG和A172细胞株中敲低CHI3L1后,肿瘤细胞株的生长、增殖及迁移能力均降低。结论:在胶质瘤细胞中,CHI3L1通过促进NF-κB p65亚基的磷酸化入核促进胶质瘤细胞中NF-κB信号通路的持续激活;在肿瘤微环境中,CHI3L1结合巨噬细胞膜上的CD44激活下游的AKT信号通路,促进巨噬细胞向M2表型分化,从而发挥促肿瘤的作用。