目的:氧气对于机体持续产生能量是必不可少的。高氧治疗是指吸入的氧气浓度大于60%。高氧治疗广泛应用于抢救重症新生儿,它可以提高血氧分压和血氧饱和度,以满足组织器官的需氧量,消除或减少缺氧对机体的不利影响,是临床上重症新生儿急救中不可或缺的成分。虽然高氧治疗提高了患儿的生存率,但是使用不当也极易引发氧损伤,其中就包括肠道损伤,必须引起高度重视。紧密连接（tight junction,TJ）是一种多蛋白质复合物,广泛存在于所有上皮或内皮细胞连接处的最顶端,包括封闭蛋白Claudins、闭合蛋白Occludin以及闭合小带蛋白（Zonula occludens,Zos）等。肠道TJ是重要的物理屏障,受损后会引起免疫系统的过度激活,导致炎症反应,与各种肠道和全身性炎症疾病的发病密切相关。B-淋巴瘤莫洛尼氏鼠白血病病毒插入区-1（B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region-1,Bmi1）和亮氨酸富含重复的G蛋白偶联受体5（Leucine‐rich repeat‐containing G‐protein coupled receptor 5,Lgr5）是公认的肠道干细胞（Intestinal Stem Cells,ISCs）的良好标记物,ISCs能够从肠隐窝向绒毛轴移动,产生一系列特化的上皮细胞,维持肠上皮的自我更新和修复,是肠功能变化和病理学改变的关键因素。高氧治疗使用不当易造成组织器官损伤,主要是因为活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平增高。ROS的产生一般有两个来源:线粒体和还原型辅酶Ⅱ氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH-oxidase）。抗氧化剂Apocynin主要是针对NADPH-oxidase来源的ROS。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）可以与羟基自由基反应,使其失活,直接作为抗氧化剂清除ROS;也可以通过增加谷胱甘肽的合成,起到间接抗氧化的作用。本研究中,旨在通过检测高氧对新生大鼠肠黏膜上皮紧密连接蛋白和肠道干细胞的影响,了解其对肠道造成损伤的作用机制;通过检测高氧中加入抗氧化剂NAC后NCM460细胞紧密连接蛋白的变化,探讨抗氧化剂NAC对肠道紧密连接蛋白的保护作用,为临床上低氧血症新生儿的氧疗救治提供理论依据。研究方法:1.建立高氧动物模型:将新生SD大鼠（连同母鼠）于出生后12 h内随机分为对照组（FiO₂=21%）和高氧组（FiO₂=80%⁸5%）,高氧组置于玻璃氧舱中,持续输入氧气,维持FiO₂=80%⁸5%。对照组置于空气中（FiO₂=21%）,其余控制因素同高氧组。2.大鼠肠道紧密连接蛋白及肠道干细胞标记物的检测:用实时定量逆转录多聚酶链式反应（Quantitive Reverse Transcripitio-Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）、免疫组织化学法和蛋白免疫印迹电泳（Western blot）检测肠道紧密连接蛋白Zo-1、Occludin、Claudin-4及肠道干细胞Bmi1和Lgr5的表达。3.细胞培养:NCM460细胞培养于正常细胞培养箱中（5%CO₂、37℃）,以1x10⁶cells/ml接种,24小时后加入不同浓度的抗氧化剂,随机置于正常培养箱中和高氧培养箱中（5%CO₂、85%O₂、37℃）。4.通过细胞增殖（MTT）实验探讨不同浓度抗氧化剂NAC和Apocynin对高氧中NCM460细胞生存能力的影响;5.利用Western Blot、RT-qPCR检测抗氧化剂NAC对高氧中NCM460细胞Zo-1、Occludin、Claudin-4的表达水平的影响。结果:1.高氧降低新生大鼠肠道紧密连接蛋白及干细胞标记物的表达:（1）Western blot检测紧密连接蛋白Zo-1、Occludin、Claudin-4,与对照组相比,各高氧组中Zo-1、Occludin、Claudin-4的蛋白表达均降低（P<0.05或P<0.01）。（2）免疫组化检测紧密连接蛋白Zo-1、Occludin、Claudin-4,其主要定位于肠上皮细胞膜和浆中,对照组中肠道染色呈黄或棕褐色,肠绒毛整齐,形态正常;高氧组肠道染色呈浅黄色,肠绒毛形态及连续性均遭到破坏。与对照组相比,各高氧组中Zo-1、Occludin、Claudin-4的蛋白表达均降低（P<0.01）。（3）RT-qPCR检测紧密连接蛋白Zo-1、Occludin、Claudin-4的mRNA,与对照组相比,各高氧组中Zo-1、Occludin、Claudin-4的mRNA表达量均降低（P<0.05或P<0.01）。（4）Western blot检测肠道干细胞Bmi1和Lgr5蛋白,与对照组相比,各高氧组中Bmi1和Lgr5的蛋白表达均降低（P<0.05或P<0.01）。（5）免疫组化检测肠道干细胞标记物Bmi1和Lgr5,Bmi1和Lgr5主要定位于肠隐窝处,对照组肠道隐窝处染色呈黄或棕褐色,高氧组染色呈浅黄色。与对照组相比,各高氧组Bmi1和Lgr5的蛋白表达均降低（P<0.05或P<0.01）。（6）RT-qPCR检测肠道干细胞Bmi1和Lgr5的mRNA,与对照组相比,各高氧组中Bmi1和Lgr5的mRNA表达量均降低（P<0.05或P<0.01）。2.不同浓度抗氧化剂对高氧中NCM460细胞的影响;（1）不同浓度抗氧化剂NAC和Apocynin对高氧中NCM460细胞生存能力的影响:20μM NAC能显著提高高氧中NCM460细胞的生存率（P<0.01）,而Apocynin没有（P>0.05）。（2）抗氧化剂NAC影响高氧中NCM460细胞紧密连接蛋白的表达:Western blot检测Zo-1、Occludin、Claudin-4的蛋白表达量,与对照组相比,高氧组Zo-1、Occludin、Claudin-4的蛋白表达量均明显降低（P<0.01）。高氧加20μM NAC组与高氧组相比,Zo-1、Occludin、Claudin-4的蛋白表达量均增加（P<0.05或P<0.01）;（3）RT-qPCR检测Zo-1、Occludin、Claudin-4的mRNA表达量,与对照组相比,高氧组Zo-1、Occludin、Claudin-4的mRNA表达量均明显降低（P<0.05或P<0.01）。高氧加20μM NAC组与高氧组相比,Zo-1、Occludin、Claudin-4的mRNA表达量均增加（P<0.01）。结论:1.高氧降低新生大鼠肠道紧密连接蛋白Zo-1、Occludin、Claudin-4和肠道干细胞标记物Bmi1、Lgr5的表达。2.抗氧化剂NAC对高氧中的NCM460细胞有保护作用。