食管癌是发生在食管鳞状上皮组织的恶性肿瘤,本病是人类常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有22万人死于食管癌。我国是食管癌高发区,全世界食管癌的新发病率约为31.04万,我国占16.72万。据我国1974-1978年间29个省、市、自治区的人口调查中发现,70万死于恶性肿瘤,其中死于食管癌者15.7万(占22.4%),仅次于胃癌(占22.8%)。食管癌死亡者仅次于胃癌居第二位,发病年龄多在40岁以上,但近年来40岁以下发病者有增长趋势。手术是食管癌首选治疗方法,目前对食管癌的根治靠手术彻底的切除加淋巴结的清扫,但是肿瘤侵犯纤维层或者侵犯周围组织后,失去手术根治的机会。但是目前公认的食管癌术后五年的生存率也仅为20%-30%。对晚期食管癌,化疗和放疗的效果相对有限。早期患者根治术后5年生存率15%-39%,但局部晚期或有远处转移疗效甚差。早在1800年,一些德国病理学家观察到部分人类肿瘤高度血管化,从而提出新生血管可能在肿瘤进展中起着重要致病作用。经过科学家们的不断寻找,终于在1971年,哈佛大学Judan Folkman博士提出肿瘤生长的血管依赖性理论,即肿瘤的增殖及其局部的浸润转移,不仅与肿瘤细胞本身有关,更离不开肿瘤生长的微环境,尤其是周边血管的支持。实体肿瘤导致死亡人数占所有癌症致死人数的85%以上,实体瘤中的肿瘤细胞和间质细胞以及血管系统及其周围的组织液共同构成了肿瘤的微环境。经过大量研究表明,肿瘤组织内的形成的血管及其构成的微环境与肿瘤生长和转移密切相关。探索肿瘤组织内血管生成的调节机制,进而抑制肿瘤血管的生成,进而达到抑制肿瘤生长,进一步达到治疗肿瘤的目的,防止肿瘤复发、转移,提高肿瘤患者的生存率及生活治疗具有重要意义。当肿瘤直径超过2mm时,直接由微环境提供的氧和营养物质已不能满足肿瘤细胞生长的需要,此时肿瘤细胞的生长依赖于新生血管供给营养物质。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是调节肿瘤组织血管形成的重要成分,并成为肿瘤发生发展及治疗中的研究热点课题。它一方面可以增加血管通透性,有利于血浆蛋白和纤维蛋白原外渗,促进血管生成和新基质形成；另一方面可以促进血管内皮细胞有丝分裂,刺激血管内皮细胞增殖,促进肿瘤内血管的生成。VEGF在肿瘤生长中的作用已被越来越多的研究所证实,如果能有效的抑制血管生成因子VEGF的表达,就有可能控制肿瘤发展甚至消灭肿瘤,即著名的饿死肿瘤的理论。在许多实验及临床的研究中,均显示出了与化疗药物及单独的抗肿瘤作用,在肝癌的研究中发现,肿瘤转移的发生率与组织内微血管数量(MCV)之间有显著的相关性,类似的研究在其他肿瘤如肺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、胆管癌等也得到证实。内源性的内皮抑素具有广泛的抗肿瘤血管生成作用,可抑制65种不同肿瘤的生长。肿瘤生长过程中分泌多种促进血管生成因子,促进血管生成。但是单独应用抗血管药物只是针对肿瘤血管起作用,但是针对肿瘤本身并未起作用。研究表明,单独应用抗血管治疗进展期肿瘤作用有限。近年来化疗联合抗血管治疗受到人们的广泛关注,研究表明血管生成抑制因子对肿瘤血管的生成主要为以下三个方面：1、抑制血管的生成2、使未成熟的血管成熟化3、已形成的血管退化。因而肿瘤血管的成熟与正常化,增加血管运输化疗药物的作用,从而发挥的强烈的杀灭肿瘤的目的。同时使肿瘤组织内血管密度下降,血流减少,肿瘤退缩。因此,抗血管生成药物联合化疗药物成为实体瘤治疗的新策略。我国自行研制的新型重组人血管内皮抑素(恩度),用大肠埃希菌表达系统生成,具有更加良好的稳定性及活性。2005年已批准联合长春瑞滨和顺铂(NP)方案治疗非小细胞肺癌,并已取得良好的效果。多项数据显示,VEGF在食管鳞癌中的阳性率为23.9%-93.3%,其表达水平明显高于正常组织,并且在食管癌的各个时期均发挥作用。与食管癌的病理学分级、肿瘤组织的浸润深度、淋巴结转移及组织分化程度高度相关。但是恩度联合以铂类为主的化疗药物是否与治疗其他癌症一样具有协同的作用。目的：本实验通过建立小鼠食管瘤模型,研究重组人血管内皮抑素联合紫杉醇+顺铂对荷瘤小鼠食管癌组织是否有联合抑制作用及探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据。方法：食管癌细胞冻存于液氮中,复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解,并将之移入离心管中,将含有10%的胎牛血清的培养基2ml加入离心管中,以800r/min离心三分钟,弃去上清液后将Eca-109食管癌细胞株传代培养。待细胞处于对数期生长时,将2×106个食管癌细胞接种于裸鼠左腋皮下,建立食管癌移植瘤模型。于一周之后皮下肿瘤成型,大小约黄豆大小,将40只荷瘤小鼠随机分成四组,对照组(生理盐水)、恩度组、紫杉醇+顺铂组(化疗组)、恩度联合紫杉醇+顺铂组(联合组),每组均为十只。对照组尾静脉注射等量生理盐水；恩度组尾静脉注射15mg/kg,d1-14；化疗组,尾静脉注射顺铂5mg/kg紫杉醇10mg/kg；联合组,尾静脉注射剂量同上。每天观察小鼠的一般情况,包括裸鼠的进食、饮水、活动情况。开始药物后每3天用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)及短径b(mm),并计算小鼠肿瘤体积(V)按下列公式计算：V=ab2/2,描绘出肿瘤生长曲线,计算肿瘤体积抑制率=(对照组平均瘤体积-治疗组平均瘤体积)/对照组平均瘤体积×100%。恩度连续用药结束后一周处死动物,取新鲜组织并计算各组肿瘤重量的抑瘤率；应用流式细胞仪测定各个实验组细胞凋亡率,比较各实验组之间凋亡率是否有统计学差异；应用免疫组化测定促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,比较各组间凋亡蛋白的表达是否有统计学差异。所有计量资料的数据均以均数士标准差表示(x±s),应用Spss13.0统计软件分析,进行方差齐性检验,满足方差齐性应用单因素方差分析Bonferroni法进行多重比较方差分析,方差不齐时应用近似F检验的Welch分析Dunnett T3法进行多重比较,按P<0.05的标准认为其有统计学意义。结果：1各组小鼠的肿瘤重量及抑瘤率：对照组、恩度组、化疗组、联合组小鼠的肿瘤重量分别为：1.654±0.040g、1.360±0.037g、0.610±0.029g、0.445±0.070g各组间比较均有统计学意义(P<0.05),恩度组、化疗组、联合组抑瘤率分别为17.17%、63.12%、73.10%。2各组小鼠的肿瘤体积：对照组(生理盐水)肿瘤体积逐渐增大,21天时体积为1247.738±12.357mm3,治疗各组小鼠肿瘤明显较对照组生长缓慢。化疗组及度联合化疗组肿瘤体积较对照肿瘤生长不明显,21天时恩度组、化疗组、联合组小鼠体积分别为599.082±5.782mm3、668.707±8.807mm31222.918±14.026mm3联合组肿瘤体积下降明显较对照组,各组比较均有统计学意义(P<0.05)。抑瘤率分别为1.99%、46.41%、51.98%。3肿瘤细胞凋亡率：流式细胞检测对照组、恩度组、化疗组、联合组凋亡率分别为1.380±0.274%、14.110±2.044%、28.190±0.643%、39.630±2.223%,与对照组相比,各用药组凋亡率较对照组增加(P<0.05),联合组凋亡率高于恩度组和化疗组(P<0.05)。4各组肿瘤组织凋亡蛋白的表达情况：对照组、恩度组、化疗组、联合组Bcl-2蛋白表达率分别为65.400±3.502%、44.700±3.466%、23.30±2.751%、5.600±1.647%,各组比较均有显著性差异(P<0.05),对照组、恩度组、化疗组、联合组Bax蛋白表达率分别为14.600±2.011%、23.000±1.490%、43.100+3.178%、56.800±3.011%,各组相比有统计学差异(P<0.05)。结论：1重组人血管内皮抑素联合化疗组能够明显抑制小鼠食管癌移植瘤的生长联合组肿瘤体积小于各实验组及对照组,有显著性差异；恩度组小鼠与对照组相比未见不良反应；联合应用与单独化疗组对比,未增加不良反应。2重组人血管内皮抑素联合化疗能够使小鼠食管癌细胞促凋亡蛋白Bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,与对照组及其他实验组相比,有显著性差异；单独应用重组人血管内皮抑素促凋亡蛋白Bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,与对照组相比有显著性差异。3重组人血管内皮抑素联合化疗能够使小鼠食管癌细胞凋亡率增加,与其他各组相比有显著性差异,单独应用重组人血管内皮抑素食管癌细胞凋亡率较对照组增加,差异有统计学意义。