背景:肝细胞肝癌是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,已成为我国第二位的癌症杀手。由于多数肝癌病人诊断时已是晚期,以手术切除为主的综合治疗效果差,导致化疗是其治疗的主要手段之一。但是,肝癌缺少特效的化疗药,并且肝细胞肝癌容易对化疗药产生耐药性。因此,研究开发针对肝细胞肝癌的抗肿瘤药物,并阐明其耐药机制是关键。近年来,有不少研究证明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)通过以下途径:抑制癌细胞的增殖、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用。Romidepsin是一种HDACi,于2009年11月被FDA批准上市,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤,随后于2011年FDA增加Romidepsin的适应证,批准其用于治疗多形T细胞淋巴瘤。但是Romidepsin是否可用于肝细胞肝癌的治疗,及如何解决该药的耐药问题,尚未见研究。因此,本研究将探讨Romidepsin应用于肝细胞肝癌可行性,进一步深入研究肝细胞肝癌对Romidepsin产生耐药机制,揭示肝细胞肝癌对抗肿瘤药物产生耐药的分子机制。目的:研究 Romidepsin 对人肝细胞肝癌 HepG2,Huh7,SK-HepG1 和 HCC-LM3(LM3)增殖、凋亡和细胞周期分布等的影响及相关机制;研究肝细胞肝癌细胞系对Romidepsin产生耐药的影响及相关机制。方法:1 Romidepsin对细胞增殖和活性的影响CCK-8(Cell counting kit-8,细胞增殖及毒性检测试剂盒)检测肝细胞肝癌在经不同浓度Romidepsin处理后的增殖抑制率;克隆形成实验检测肝细胞肝癌在经不同浓度Romidepsin处理后克隆形成率的影响;EdU检测Romidepsin对肝细胞肝癌细胞活性的影响;计算Romidepsin作用于肝细胞肝癌的IC50。2 Romidepsin对肝癌细胞系周期的影响利用流式细胞术检测Romidepsin作用后肝癌细胞系Huh-7/HCC-LM3周期的变化;利用Western Blot检测Romidepsin作用后肝癌细胞系Huh-7/HCC-LM3周期相关蛋白的变化。3 Romidepsin对肝癌细胞系凋亡的影响利用流式细胞术检测Romidepsin作用后肝癌细胞系Huh-7/HCC-LM3凋亡变化;利用Western Blot检测Romidepsin作用后肝癌细胞系Huh-7/HCC-LM3凋亡相关蛋白的变化。4 Romidepsin对肝细胞肝癌系MAPK通路的影响Romidepsin对肝细胞肝癌系MAPK通路,包括Erk、P38和JNK的影响;应用通路阻断剂,验证Erk、p38和JNK通路在周期阻滞和凋亡中发挥的作用;验证MAPK下游caspase-3在Romidepsin诱导的凋亡中发挥的作用。5 Romidepsin在体内对裸鼠体内成瘤的影响为了验证细胞水平上的实验结果,我们种植肝癌Huh7细胞于裸鼠皮下,在体内证明Romidepsin抑制肝癌细胞肿瘤的作用。6 Romidepsin作用于肝癌细胞后,自噬水平的变化。Western blot检测Romidepsin作用肝细胞肝癌后自噬相关蛋白变化;Autophagy Assay Kit验证Romidepsin可以诱导肝细胞肝癌产生自噬;采用免疫荧光检测Romidepsin对细胞自噬流的影响;透射电镜电镜下找自噬体。7体内外验证,自噬介导了肝细胞肝癌对Romidepsin的耐药性利用自噬抑制剂3-MA和HCQ联合Romidepsin作用于肝细胞肝癌,抑制自噬,可以提高Romidepsin的疗效;构建慢病毒转染敲除(shRNA)自噬关键基因ATG5/ATG7,验证自噬介导Romidepsin耐药。同时体内实验验证,HCQ可以提高Romidepsin的化疗效果。结果:1利用CCK-8实验发现Romidepsin抑制肝细胞肝癌系增殖呈浓度和时间依赖性;克隆实验发现Romidepsin可以抑制肝细胞肝癌增殖,减弱肝细胞肝癌的克隆形成能力;EdU实验发现,随着Romidepsin浓度的升高,细胞活性逐渐降低;随着时间的增加,Romidepsin作用于肝肝细胞肝癌的IC50逐渐减少。2利用流式细胞术检测检测细胞周期的变化,随着Romidepsin处理肝细胞肝癌浓度的升高,细胞中的G2/M期细胞逐渐升高;Western Blot检测,发现Romidepsin通过调控p27/p21/cdc25C/cdc2/cyclinB1表达,导致肝细胞肝癌周期阻滞在G2/M期。3利用流式细胞术检测Romidepsin处理肝细胞肝癌,Romidepsin导致肝细胞肝癌凋亡,呈时间和浓度依赖性;WestemBlot检测结果提示,Romidepsin导致肝细胞肝癌通过调控c-PARP/c-caspase-9/c-caspase-3蛋白表达,导致细胞凋亡。4利用Western Blot检测,发现随着Romidepsin浓度的升高,p-Erk和p-JNK的表达逐渐升高;Romidepsin是通过活化肝癌的Erk通路,导致细胞周期阻滞;Romidepsin是通过活化JNK通路导致肝癌细胞凋亡;Romidepsin是通过活化p-Erk导致肝癌细胞周期阻滞。5裸鼠体内成瘤验证Romidepsin肝癌细胞肿瘤的抑制作用,实验结果表明Romidepsin处理后的裸鼠瘤体大小,生长速度以及重量明显低于对照组,动物体重未见明显改变。Western Blot检测周期相关p-cdc25C/p-cdc2/Ki67/p-Erk和凋亡相关c-caspase-3/c-PARP/c-caspase-9/p-JNK,结果显示与体外实验一致。免疫组化检测 p-cdc25C/Ki67/c-caspase-3/c-PARP,结果与 Western Blot 结果一致;H&E 染色证实Romidepsin对裸鼠各大器官无明显的毒副作用。6 Western blot检测Romidepsin作用肝细胞肝癌后自噬蛋白升高;Autophagy Assay Kit验证Romidepsin可以诱导肝细胞肝癌产生自噬;Romidepsin作用于肝细胞肝癌后,自噬流增加明显;透射电镜发现Romidepsin作用后细胞内自噬体明显增多。7流式细胞仪检测Romidepsin+自噬抑制剂,较单用Romidepsin,凋亡明显增加;Romidepsin+shRNA-ATG5/ATG7,较单用 Romidepsin,凋亡明显增加。体内实验验证,HCQ抑制自噬后,可以提高Romidepsin对肝细胞肝癌的抑制作用。结论:1体内外实验证明Romidepsin是通过Erk/cdc25C/cdc2/cyclinB信号通路诱导肝细胞肝癌发生G2/M期阻滞,通过JNK/c-Jun/caspase3信号通路诱导肝细胞肝癌凋亡;2 Romidepsin直接诱导肝细胞肝癌发生自噬,促进了肝细胞肝癌化疗耐药;抑制自噬,可以提高Romidepsin的治疗效果。