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目的:利用化疗药物富集小鼠乳腺癌细胞系4T1中肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC),研究肿瘤干细胞的一些耐药机制,为进一步探索乳腺癌干细胞的调控机制、开发靶向乳腺癌干细胞的分子制剂奠定基础。方法:1化疗药富集乳腺癌干细胞动物模型的建立。收集对数生长期4T1细胞,接种于BALB/c小鼠右肩胛部皮下,建立小鼠乳腺癌模型。将小鼠随机分为4组,分别为对照组和5-氟尿嘧啶(5-Fu)低、中、高浓度处理组。待小鼠成瘤后,对照组给予生理盐水,5-Fu处理组分别给予低、中、高浓度(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml)5-Fu腹腔注射,每天一次,共用七天,七天后改为一周一次,四周后引颈处死小鼠,将肿瘤组织分为三份,一份以中性甲醛固定进行免疫组化检测,一份用于RNA提取,一份制成细胞悬液用于流式检测CD44+CD24-/low细胞比例和Hoechest33342染色检测侧群(side population, SP)细胞比例。取CD44+CD24-/low细胞比例最高的5-Fu处理组小鼠肿瘤组织,制备细胞悬液,建立第二代富集CSC的小鼠移植瘤模型,荷瘤小鼠用相同浓度5-Fu化疗,用药方法同前,如此传代共制作四代小鼠移植瘤模型。2采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测各代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞的比例。3采用Hoechst33342染色法检测各代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤模型肿瘤组织中SP细胞比例。4免疫组化法检测各代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤模型肿瘤组织中CD55和ALDH1蛋白的表达。5观察无血清培养各代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤组织细胞微球体的形成,计数微球体的数目并计算微球体的形成效率。6观察第三代5-Fu处理组小鼠移植瘤细胞形成的微球体在有血清培养环境下的诱导分化。7动物致瘤实验检测第三代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤细胞的致瘤能力。8经HE染色,光镜下观察小鼠移植瘤模型肿瘤组织形态学变化。9采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量和实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测第三代对照组和5-Fu处理组小鼠移植瘤组织中MDR1、BCRP、ALDH1和β-catenin mRNA的表达。结果:1利用化疗药5-Fu诱导下4T1细胞系在小鼠体内传代的方法,建立了富集乳腺癌干细胞的小鼠移植瘤模型,将从5-Fu处理组第一、二、三、四代小鼠模型肿瘤组织中分离所得细胞分别命名为4T1-1st、4T1-2nd、4T1-3rd、4T1-4th细胞,而对照组小鼠肿瘤组织分离所得细胞命名为parental 4T1细胞。2 FCM检测结果显示,第一代对照组小鼠移植瘤组织中CD44+CD24-low细胞比例为11.5±0.9%,低、中、高浓度5-Fu处理后其比例分别为40.1±3.4%、49.8±1.2%、45.6±1.6%,明显高于对照组(P<0.05)。中、高浓度组明显高于低浓度组(P<0.05),而中、高浓度组之间无明显差异(P>0.05)。中浓度5-Fu处理后小鼠移植瘤组织中CD44+CD24-low细胞比例高于其它两组,所以选择中浓度(0.1mg/ml)5-Fu进行后续的实验。5-Fu处理组第一、二、三、四代小鼠移植瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例分别为49.8±1.26%、56.8±1.76%、66.4±1.5%、69.0±1.6%,显著高于对照组(P<0.01)。随着传代次数的增加,CD44+CD24-/low细胞比例逐渐升高,除第三、四代之间差异不明显(P>0.05)外,其他各代之间差异具有统计学意义(P<0.05)。3 Hoechst33342染色结果显示,5-Fu处理组第一、二、三、四代小鼠移植瘤组织中SP细胞比例分别为25.0±1.21%、42.6±2.8%、58.4±2.2%、61.3±2.6%,显著高于对照组的9.7±1.4%(P<0.01)。随着传代次数的增加,SP细胞比例逐渐升高,除第三、四代之间差异不明显(P>0.05)外,其他各代之间差异具有统计学意义(P<0.05)。4免疫组化结果显示,对照组小鼠移植瘤组织中ALDH1表达为阴性,5-Fu处理组第一、二、三、四代小鼠移植瘤组织ALDH1表达为弱阳性到阳性,随着传代次数的增加5-Fu处理组ALDH1表达水平逐渐升高。5-Fu处理组第一、二、三、四代小鼠移植瘤组织中CD55强表达细胞数分别为7.8±1.6%、10.1±2.0%、15.6.±1.4%、17.3±1.9%,明显高于对照组的0.6±0.3%(P<0.01),且随着传代次数的增加5-Fu处理组CD55表达水平逐渐升高。5无血清培养小鼠移植瘤细胞结果显示,4T1-3rd细胞微球体形成效率为5.9±0.4%,parental 4T1细胞微球体形成效率为0.5±0.2%,前者约是后者的12倍(P<0.01);4T1-3rd细胞形成的第一代微球体可以传代形成相同比例的第二、三代微球体且可传至5代,而parental 4T1细胞形成的微球体只传至3代后就不再形成细胞球,开始黏附、分化。4T1-4th细胞微球体形成效率为6.1±0.3%,与4T1-3rd细胞之间无明显差异(P>0.05)。6有血清培养微球体的诱导分化结果显示,4T1-3rd微球体细胞可在有血清培养基中逐渐贴壁分化,并且可以连续传代。7动物致瘤实验结果显示,4T1-3rd细胞的致瘤能力明显高于parental 4T1细胞。8经HE染色光镜下观察结果显示,所有荷瘤小鼠的移植瘤组织均为乳腺癌组织,接种4T1-3rd细胞和parental 4T1细胞的小鼠肿瘤组织在形态学上无明显差异。9半定量RT-PCR检测结果显示,第三代5-Fu处理组小鼠移植瘤组织中MDR1、BCRP、ALDH1mRNA表达水平升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01),而β-catenin mRNA的表达水平在两组之间未见明显差异(P>0.05)。Rt-PCR检测结果显示,5-Fu处理组小鼠移植瘤组织中MDR1、BCRP和ALDH1mRNA的表达较对照组分别上调了4.35、6.14、3.78倍,二者相比差异具有统计学意义(P<0.01);β-catenin mRNA的表达上调了1.75倍,二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1利用化疗药5-Fu富集的乳腺癌干细胞建立了荷瘤小鼠动物模型,经在小鼠体内传代产生了高度恶性的小鼠乳腺癌细胞4T1-3rd,4T1-3rd细胞中富集了高纯度的CSC,提示应用化疗药是筛选乳腺癌干细胞的有效方法。2第三代5-Fu处理组小鼠移植瘤组织高表达MDR1和BCRP,说明乳腺癌干细胞可能通过MDR1和BCRP表达上调产生对化疗药物的抵抗性,逃逸化疗药物的攻击。3第三代5-Fu处理组小鼠移植瘤组织中β-catenin表达水平升高,提示Wnt信号转导通路的活化可能参与了乳腺癌干细胞的调控,但与乳腺癌干细胞耐药有无关系还需进一步研究明确。4 5-Fu处理组小鼠移植瘤组织中高表达CD55和ALDH1,提示CD55和ALDH1可作为乳腺癌干细胞新的肿瘤标志物。