中风仍然是全球卫生负担,约有1370万人患有中风及其并发症,如运动功能下降和神经行为变化,中风可分为缺血性中风和出血性中风,后者则不太常见。缺血性中风由脑动脉内形成的血块引起,可导致脑梗死和神经缺陷。虽然再灌注可以增加缺血区的血液供应,但会促进氧化应激和炎症的发生,导致神经元细胞进一步恶化死亡,这种现象被称为缺血/再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion,I/R）。已有充分证据证明,炎症反应和缺血后发生的氧化应激反应受RhoA（Ras同源基因家族,成员A）的调节。RhoA及其下游效应子ROCK（Rho依赖性卷曲螺旋激酶）的激活可以诱导LIM激酶（LIMK）和肌动蛋白解聚因子cofilin（CFL）的磷酸化,从而加剧神经炎症和细胞毒性。对于脑I/R损伤,脑血管直径的变化是至关重要的,因为它可以通过血管平滑肌的收缩和舒张供给脑组织所需要的血流量和氧气。而在血管中,硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）可以调节血管张力,抑制增殖,对血管平滑肌细胞（VSMC）的凋亡和自噬产生双向作用,是体内重要的气体信号分子。其主要是由胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合成酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）催化生成。此外,许多血管重塑相关疾病的发展,包括高血压、动脉粥样硬化和肺动脉高压,已被证明与H2S生成受损有关。但是内源性H2S是否通过RhoA-ROCK信号通路发挥作用呢?尚未见这方面的详细报道。随着对中药的不断研究,发现中药的作用越来越广泛。研究表明杜鹃花总黄酮（Total flavones of Rhododendra,TFR）具有保护脑损伤,舒张血管等作用,但其舒张血管作用的机制并不清楚。因此,本课题通过建立脑缺血再灌注模型观察体内H2S对脑损伤的保护作用以及与RhoA-ROCK信号通路的关系。并且在体外观察了内源性H2S在基底动脉血管舒张中的作用以及与RhoA-ROCK信号通路的关系,同时探讨了TFR舒张血管作用与内源性H2S的关系。目的1.研究CSE产生的H2S增加脑血流和抗缺血性脑损伤作用与RhoA-ROCK信号通路的关系。2.研究内皮源性H2S介导的脑血管舒张反应与RhoA-ROCK信号通路的关系。3.研究TFR舒张脑血管作用与H2S通路的关系。方法1.采用双侧颈总动脉结扎法构建小鼠脑缺血再灌注模型,分别于缺血前,缺血后以及再灌注20 min内采用激光散斑血流仪监测脑血流量的变化。实验分组:WT鼠分为假手术组、模型组、L-Cys组、Na HS组、PPG组、以及PPG和L-Cys合用组,敲除鼠分为假手术组,模型组,L-Cys组。2.采用病理切片染色法观察脑缺血再灌注后L-Cys和Na HS对脑组织海马区病理形态学变化的影响。3.采用亚甲蓝法测定脑缺血再灌注损伤后血清中硫化氢含量。4.采用试剂盒检测脑缺血再灌注损伤后血清中乳酸脱氢酶含量。5.采用酶联免疫法检测脑缺血再灌注损伤后脑组织中神经元特异性烯醇化酶含量,RhoA和ROCK2活性。6.采用Western Blot法测定脑缺血再灌注损伤后脑组织中ROCK2蛋白的表达。7.采用离体血管环实验观察大鼠脑基底动脉在不同抑制剂预处理下对ACh和TFR的舒张作用。结果1.脑血流量检测结果显示,在WT小鼠中,与假手术组相比,模型组在脑I/R后20 min内血流量均有明显减少。与模型组相比,底物L-Cys组和Na HS组小鼠脑血流量分别在再灌注5 min和10 min时就有明显的恢复,在20 min时基本恢复到假手术组水平。CSE抑制剂PPG对脑血流没有明显的影响,但可显著地减弱L-Cys对血流量的恢复作用。而在ROCK2敲除鼠中,与模型组相比,L-Cys组小鼠再灌注后20 min内并没有恢复到缺血前水平。结果提示L-Cys可通过CSE促进脑I/R损伤小鼠脑血流量的恢复,且与ROCK2的存在密切相关。2.病理切片染色观察脑部海马区的病理形态变化实验结果表明,在WT小鼠中,假手术组海马区的神经元细胞体积较大且为圆形,具有明显的核仁。细胞排列成多层,整齐而致密。然而,模型组海马区神经元或锥体细胞呈三角形或不规则形状,细胞皱缩,具有看不见的核仁和无序排列。与模型组相比,Na HS组和L-Cys组可以明显改善病理损伤,大多数神经细胞恢复正常,只有少数神经细胞皱缩,神经元坏死得到改善,正常细胞数量增加。PPG组损伤并没有改善,但PPG可以降低L-Cys的保护作用。而在ROCK2敲除鼠中,与模型组相比,L-Cys没有改善病理区的损伤。结果表明L-Cys可通过CSE对小鼠脑组织中海马区神经元的I/R损伤产生保护作用,并且此作用与ROCK2密切相关。3.通过测定H2S的含量与LDH的活性结果表明,在WT小鼠中,与假手术组相比,模型组血清中H2S的含量显著降低,而LDH活性明显升高。与模型组相比,Na HS组和L-Cys组的血清中H2S的含量均有明显的升高,LDH活性明显降低。PPG对血清中H2S含量和LDH活性无明显的影响,但可显著地减弱L-Cys升高血清中H2S含量和降低LDH活性的作用。而在ROCK2敲除鼠中,与模型组相比,L-Cys组的血清中H2S的含量并没有升高,LDH活性也没有改变。表明L-Cys可通过CSE产生H2S而抑制脑I/R损伤诱导的小鼠血清中H2S的降低和LDH的升高,并且此作用与ROCK2密切相关。4.通过测定NSE,RhoA和ROCK2活性结果表明,在WT小鼠中,与假手术组相比,模型组脑组织中的NSE含量明显降低,RhoA和ROCK2的活性明显升高。与模型组相比,Na HS组和L-Cys组的NSE的含量有明显升高,RhoA和ROCK2的活性降低。PPG对脑组织中NSE,RhoA和ROCK2的活性没有影响,但可明显减弱L-Cys抑制I/R损伤诱导的NSE含量的降低以及RhoA和ROCK2活性的升高作用。在ROCK2敲除鼠中,L-Cys组脑组织中NSE,RhoA和ROCK2的活性与模型组差异不大。结果表明L-Cys可通过CSE产生H2S而降低小鼠脑I/R损伤引起的脑组织中NSE降低和RhoA和ROCK2活性升高,并且此作用与ROCK2密切相关。5.Western Blot法测定ROCK2蛋白的表达实验结果表明,在WT小鼠中,与假手术组相比,模型组的脑组织中ROCK2蛋白表达明显升高,Na HS和L-Cys可明显地降低小鼠脑I/R引起的ROCK2蛋白表达的升高。PPG对ROCK2蛋白的表达无明显影响,但可明显减弱L-Cys对I/R损伤诱导的ROCK2蛋白表达增高的降低作用。结果表明,L-Cys可通过CSE产生H2S抑制I/R损伤诱导的小鼠脑组织中ROCK2蛋白表达的增高。6.离体血管环实验结果表明,ACh在1×10-7 mol·L-1～1×10-5 mol·L-1范围内,可明显并呈浓度依赖性地舒张大鼠脑基底动脉,并且可被CSE抑制剂PPG(1×10-4mol·L-1)预处理明显减弱,但不被3-MST抑制剂Asp(1×10-3mol·L-1)预处理所影响,且PPG和Asp本身在一定浓度范围内并不改变血管直径。RhoA抑制剂CCG-1423和ROCK2抑制剂KD-025在一定浓度范围内可以不同程度的舒张KCl预收缩的血管,且CCG-1423(1×10-6mol·L-1)和KD-025(1×10-7mol·L-1)预处理均可明显地减弱ACh诱导的大鼠脑基底动脉的舒张反应,CCG-1423和KD-025分别与PPG合用预处理,均可进一步减弱ACh的舒张作用,但与Asp合用预处理则无进一步减弱ACh的舒张作用。TFR可舒张大鼠脑基底动脉,最高可舒张70%。CSE酶抑制剂PPG预处理可明显降低TFR的舒张作用,而3-MST抑制剂Asp降低TFR的舒张作用并不明显。合用PPG和Asp后可进一步降低TFR的舒张作用。结论1.CSE产生的H2S对小鼠脑I/R损伤有保护作用,其作用可能与抑制RhoA-ROCK信号通路及增加脑血流量有关。2.内皮源性H2S舒张脑血管的作用与抑制RhoA-ROCK信号通路有关。3.TFR舒张脑血管的作用与激活内源性H2S的产生有关。