论文部分内容阅读
缺血性脑损伤是一种临床上的常见病,残疾率和死亡率居全世界的前几位。其发病机制复杂,临床治疗效果不理想,严重影响了人们的生活和工作。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）被称为除一氧化碳（Carbon monoxide,CO）和一氧化氮（Nitric oxide,NO）之外的第三种内源性气态信号递质,多年的科学研究揭示脑组织中存在生理浓度的H2S。内源性H2S可通过胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）和胱硫醚-β-合成酶（L-cystathionine-β-synthetase,CBS）催化L-半胱氨酸（L-cysteine,L-Cys）生成。另外,3-巯基丙酮酸硫基转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）与半胱氨酸氨基转移酶（Cysteine aminotransferase,CAT）协同也可生成H2S。与NO一样,H2S也是一种血管内皮衍生舒张因子,可在大脑神经调节和血管舒张等过程中发挥信号分子的作用。课题组前期的研究表明脑血管内皮释放的H2S可引起脑血管平滑肌细胞超极化和血管舒张反应,促进平滑肌细胞钙激活钾通道的开放,并对缺血性脑损伤产生保护作用。但迄今不清楚脑血管产生的内皮源性H2S可否穿透血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）对缺氧复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤的神经细胞发挥保护作用,该问题的阐明对认识脑血管内皮对神经细胞功能的调节和缺血性脑损伤病理机制有着十分重要的意义。在研究H2S的神经生物学作用时,检测脑组织中H2S的浓度是十分重要的。气相色谱-质谱法（Gas chromatograph-mass spectrometry,GC-MS）灵敏度高,检测限低,适用于生物样品中H2S的测定。因此,本研究拟建立检测脑组织中H2S浓度的GC-MS法,对H2S是否可透过BBB进行分析,并且探讨内皮源性H2S对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用及机制。目的:1.建立并优化GC-MS法测定大鼠脑组织中H2S的方法,在整体动物上探讨H2S可否透过BBB。2.在体外BBB模型上探讨H2S可否透过BBB。3.探讨内皮源性H2S对大鼠海马神经元H/R损伤产生保护作用及机制。方法:1.采用安捷伦7890B-7000D气相色谱三重四极杆质谱仪,多反应检测扫描（Multiple reaction monitoring,MRM）模式,对H2S的衍生物双五氟苄基硫醚（Bispentafluorobenzyl sulfide,Bis）的离子对（m/z 394→181,m/z 181→161）进行定量、定性分析。大鼠尾静脉注射三种剂量的Na HS,0.5 h后取脑组织进行衍生化反应,采用GC-MS法检测H2S浓度。2.将小鼠脑微血管内皮细胞（Mouse brain microvascular endothelial cells,b End.3细胞）与大鼠胶质瘤细胞（Rat glioma cells,C6细胞）分别接种在Transwell小室的两侧建立体外BBB模型,通过渗漏实验和荧光素钠的渗透系数检验BBB模型的功能。采用GC-MS法检测H2S在体外BBB模型上的透过性。3.建立体外BBB模型,将大鼠海马神经元接种在Transwell系统配套的12孔板中,分组为:（1）Control;（2）H/R;（3）Na HS(200μmol·L-1);（4）L-Cys(50μmol·L-1);（5）L-Cys(100μmol·L-1);（6）L-Cys(200μmol·L-1);（7）CSE抑制剂PPG(100μmol·L-1);（8）L-Cys(200μmol·L-1)+PPG(100μmol·L-1);（9）CBS抑制剂AOAA(1000μmol·L-1);（10）L-Cys(200μmol·L-1)+AOAA(1000μmol·L-1);（11）L-Cys(200μmol·L-1)+PPG(100μmol·L-1)+AOAA(1000μmol·L-1)。3～11组均进行H/R损伤,并且在损伤过程中加入相应药物。通过乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase,LDH）、神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase,NSE）和细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）检测细胞损伤与细胞活力;GC-MS法检测H2S浓度;钙荧光成像法检测海马神经细胞内游离Ca2+浓度。结果:1.脑组织样本中硫氢化钠（Sodium sulfide,Na HS）在0.25～256μmol·L-1范围内具有良好的线性关系,检测限为0.1μmol·L-1,日内、日间精密度均小于15%,回收率在90%以上,无明显的基质效应。测得大鼠脑皮质组织中基础H2S浓度为（11.84±0.38）μmol·L-1,静脉注射Na HS后,脑组织中H2S浓度呈显著和剂量依赖性增高。2.渗漏实验显示:空白对照组培养4 h后液面差变为0 cm,而BBB模型组培养4h后能维持≥0.5 cm的液面差（液面差浮动≤0.1cm）。荧光素钠在体外BBB模型中的渗透系数明显小于空白对照组,为（7.89±1.15）×10-6 cm·s-1,与文献报道的在2～19×10-6 cm·s-1范围一致。这些结果表明体外BBB模型建立成功。3.在体外BBB模型中,随着内室（内皮细胞侧）加入Na HS浓度的增加,外室（神经细胞侧）培养基中H2S浓度呈显著和剂量依赖性增加,表明H2S可通过体外的BBB,从内皮细胞侧穿透至神经细胞侧。此外,随着外室（神经细胞侧）加入Na HS浓度的增加,内室（内皮细胞侧）培养基中H2S浓度呈显著和剂量依赖性增加,表明H2S可通过体外的BBB,从神经细胞侧穿透至内皮细胞侧。4.H/R损伤后,培养液上清中LDH和NSE漏出明显增多,神经细胞活力显著下降（与Control组相比,P＜0.01）。Na HS(200μmol·L-1)、L-Cys中、高剂量(100、200μmol·L-1)预处理可明显减少LDH和NSE的漏出,提高细胞活力（与H/R组相比,P＜0.05或0.01）。CSE阻断剂PPG(100μmol·L-1)、CBS阻断剂AOAA(1000μmol·L-1)单独应用对LDH和NSE漏出,细胞活力无明显影响。但L-Cys(200μmol·L-1)预处理减少的LDH和NSE漏出,提高的细胞活力可被PPG、AOAA减弱（与L-Cys组相比,P＜0.05或0.01）,二者合用减弱作用明显增强（与L-Cys+PPG+AOAA组相比,P＜0.05或0.01）。5.H/R损伤后,培养液上清中H2S浓度明显降低,海马神经元Ca2+荧光强度显著增强（与Control组相比,P＜0.01）。Na HS(200μmol·L-1)、L-Cys(200μmol·L-1)预处理可显著增加培养液上清中H2S浓度,减弱神经元Ca2+荧光强度（与H/R组相比,P＜0.01）。CSE阻断剂PPG(100μmol·L-1)、CBS阻断剂AOAA(1000μmol·L-1)单独应用对H2S浓度和神经元Ca2+荧光强度无明显影响。但L-Cys(200μmol·L-1)预处理增加的H2S浓度,减弱的Ca2+荧光强度可被PPG、AOAA减弱（与L-Cys组相比,P＜0.05或0.01）,并且PPG与AOAA合用减弱L-Cys作用明显加重（与L-Cys+PPG+AOAA组相比,P＜0.05）。结论:1.本文建立的GC-MS法是检测脑组织中H2S的一个可靠、有效的方法。2.H2S可穿透BBB进入脑组织中。3.海马神经元中CBS可产生H2S对自身H/R损伤产生保护作用,内皮细胞CSE产生的H2S也可透过BBB对海马神经元H/R损伤产生保护作用,其机制可能与H2S抑制海马神经元内Ca2+有关。