论文部分内容阅读
目的:探讨痛风性关节炎大鼠TLR4炎性通路与肠道微生物的相关关系。方法:选择5周龄Wistar雄性大鼠,建立急性关节炎、高尿酸血症、痛风性关节炎模型,同时选择同种类雄性大鼠建立空白对照组。7周后利用呼吸麻醉法麻醉大鼠后剪开腹腔采集大鼠腹腔动脉血、空肠结肠组织以及大鼠粪便。使用酶联免疫分析法检测大鼠血液中炎性指标、尿酸酶法检测大鼠血尿酸值、实时定量PCR检测大鼠肠道组织TLR4炎性通路相关m RNA表达、蛋白免疫印迹法检测大鼠肠道组织相关蛋白表达、Illumina高通量测序平台检测大鼠肠道菌群16S r DNA。结果:1)空白对照组与高尿酸血症组、痛风性关节炎组相比,血尿酸值差异具有统计学意义（P＜0.05）;急性关节炎组与高尿酸血症组、痛风性关节炎组相比,差异也均具有统计学意义（P＜0.05）。2)急性关节炎组、高尿酸血症组、痛风性关节炎组与空白对照组相比,在血清NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α含量上差异均具有统计学意义（P＜0.05）,且痛风性关节炎组的NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α明显高于其他三组;急性关节炎组、高尿酸血症组与痛风性关节炎组相比,在NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α上差异也均具有统计学意义（P＜0.05）。3)空白对照组、急性关节炎组、高尿酸血症组以及痛风性关节炎组4组间肠道组织TLR4、NF-κB m RNA表达量差异具有统计学意义（P＜0.05）;其中空白对照组与高尿酸血症组、痛风性关节炎组间TLR4 m RNA差异有统计学意义（P＜0.05）,急性关节炎组与痛风性关节炎组间差异有统计学意义（P＜0.05）,高尿酸组和痛风性关节炎组的TLR4 m RNA表达量升高;空白对照组和高尿酸血症组、痛风性关节炎组NF-κB m RNA表达量差异具有统计学意义（P＜0.05）。4)空白对照组和高尿酸血症组NF-κB蛋白表达量差异有统计学意义（P＜0.05）,空白对照组、急性关节炎组与痛风性关节炎组TLR4蛋白表达量差异有统计学意义（P＜0.05）,痛风性关节炎组TLR4蛋白表达量与其他3组相比升高。5)Illumina高通量测序平台共测得3275377条ASVs序列,其中空白对照组ASVs数量为869310条,急性关节炎组852301条,高尿酸血症组697749条,痛风性关节炎组856017条。韦恩图可显示各组样本共有及特有的ASVs数量,四组共有的ASVs有969个,空白对照组特有的ASVs有5533个,急性关节炎组特有的ASVs有6349个,高尿酸血症组特有的ASVs有5106个,痛风性关节炎组特有的ASVs有5041个。6)空白对照组以Lactobacillus（乳酸菌属）的相对丰度较高（P＜0.05）,急性关节炎组以Oscillospira（颤螺菌科）、Clostridiaceae＿Clostridium（梭菌科梭菌属）的相对丰度较高（P＜0.05）,高尿酸血症组以Coprococcus、Prevotella（普氏菌属）的相对丰度较高（P＜0.05）,痛风性关节炎组以Prevotella（普氏菌属）、Turicibacter的相对丰度较高（P＜0.05）。7)四组间Alpha多样性指数显示,空白对照组、急性关节炎组、高尿酸组和痛风性关节炎组之间肠道菌群物种丰富度、多样性和均匀度差异均无统计学意义（P＞0.05）。8)四组间Beta多样性分析显示,空白对照组与高尿酸血症组、痛风性关节炎组间的物种差异具有统计学意义（P＜0.05）,急性关节炎组与高尿酸血症组、痛风性关节炎组间的物种差异具有统计学意义（P＜0.05）,高尿酸血症组与痛风性关节炎组间的物种差异具有统计学意义（P＜0.05）。9)Metagenome Seq分析显示,空白对照组和高尿酸血症组组间物种有显著差异（P＜0.05）,空白对照组和痛风性关节炎组组间物种有显著差异（P＜0.05）,急性关节炎组和高尿酸血症组组间物种有显著差异（P＜0.05）,高尿酸血症组和痛风性关节炎组组间物种有显著差异（P＜0.05）。10)利用LEf Se分析对各组标志物种进行分析,结果显示空白对照组以丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、Aerococcaceae、气球菌属（Aerococcus）、放线菌目（Actinomycetales）、罗氏菌属（Rothia）、链球菌科（Streptococcaceae）、甲基杆菌科（Methylobacteriaceae）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、阿克曼菌属（Akkermansia）相对富集;急性关节炎组以梭状芽胞杆菌（Clostridia）、颤螺旋菌属（Oscillospira）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相对富集;高尿酸血症组以普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普氏菌属（Prevotella）、节杆菌属（Arthrobacter）等相对富集;痛风性关节炎组以产芽孢菌（Erysipelotrichi）、丹毒丝菌属（Erysipelotrichales）、异杆菌属（Allobaculum）、布劳特氏菌属（Blautia）、多尔氏菌属（Dorea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、魏斯氏菌属（Weissella）、动球菌属（planococcus）等相对富集。11)TLR4炎性通路与肠道菌群相关性分析显示,梭菌属、假单胞菌属细菌相对丰度与TLR4 m RNA呈负相关关系（P＜0.05）,普氏菌属细菌相对丰度与TLR4 m RNA呈正相关关系（P＜0.05）;梭菌属细菌相对丰度与NF-κB m RNA呈负相关关系（P＜0.05）,普氏菌属与NF-κB m RNA呈正相关关系（P＜0.05）;梭菌属与TLR4、NF-κB蛋白呈负相关关系（P＜0.05）,乳杆菌属、假单胞菌属与NF-κB蛋白呈负相关关系（P＜0.05）,普氏菌属与NF-κB蛋白呈正相关关系（P＜0.05）;乳杆菌属、梭菌属、假单胞菌属与血清中NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4呈负相关关系（P＜0.05）,普氏菌属与血清中NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α呈正相关关系（P＜0.05）;梭菌属与血尿酸呈负相关关系（P＜0.05）,普氏菌属与血尿酸呈正相关关系（P＜0.05）。结论:高尿酸血症、痛风性关节炎大鼠肠道菌群多样性降低,在门属水平发生了变化,肠道微生物失调可能通过影响TLR4炎性通路相关蛋白的表达参与了痛风的发生。