1．研究背景 随着人口老龄化，各种与年龄相关的疾病日益成为人们关注的焦点，骨质疏松症就是在老年人群中非常常见的病症。骨质疏松症是以骨总量的减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨脆性增加，易于并发骨折的一种全身骨骼退行性疾病。骨质疏松症的危险因子较多，诸如年龄、性别、遗传、膳食、运动及激素水平等。其中由于绝经后卵巢分泌雌激素的功能减退，造成体内雌激素水平迅速降低而引起的绝经后骨质疏松尤为常见。现在临床常用雌激素替代疗法虽疗效为满意，但长期使用伴随的不良反应(如该药在肝脏灭活，尤其对已有肝功能不良的患者，更加加重会肝脏负担；子宫内膜过度增生及子宫出血，甚至诱发子宫内膜癌和乳腺痛)，限制了此类药物的长期普遍使用，因此寻找其他的替代药物或治疗方法是十分必要的。 近年来，膳食中大豆及大豆制品的摄入对骨质疏松症发生的影响越来越受到重视。流行病学调查显示东、西方妇女绝经后骨质疏松症的发病率的差异与东方人膳食中富含大豆制品有关。进一步研究显示大豆及大豆制品中的异黄酮对骨质疏松症有一定的预防作用。异黄酮是植物雌激素的一种。植物雌激素(phytoestrogens)是存在于植物中，结构与雌激素相似、并具有较弱雌激素效能的一大类天然化合物。人类可从植物中获取，经过肠道中的一系列化学变化将其活化以发挥雌激素效应，对内源性雌激素不足所致激素相关性疾病有广泛的预防作用，如更年期综合征、骨质疏松症、动脉粥样硬化、高血脂及部分激素相关肿瘤等。更重要的是这类物质的作用范围不如雌激素广泛，对生殖器官和乳腺的刺激作用小，因而产生的副作用也较雌激较少，从而使其具有诱人的临床应用前景，目前异黄酮的使用在一些国家已进入临床试验阶段。就目前而言，异黄酮预防骨质疏松症的研究主要来自组织培养、细胞培养和动物实验，并且结果较为肯定：异黄酮可以促进成骨细胞增殖和蛋白质的合成，抑制破骨细胞增殖，促进骨生成，抑制骨吸收。但对于异黄酮对，骨质疏松症骨的作用机制方面的研究还不是很清楚。 骨髓腔是两种干细胞的贮存库，除了造血干细胞之外还包括骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)，又称为骨髓基质干细胞(bone marrow-derived stem cells)，被认为是胚胎期间充质干细胞在体内的残留，可以向多种间质细胞分化，是出生后骨改建过程中成骨 硕十学位论文 小文IIb耍绷胞最主要的来源，对忖总量的维持具有乘奖意义。I；1前分离、培养I3MSCs的技术发展得较为完善，并仁可以在休外特定的条件下诱导其分化，包括匠 成骨细胞气 软骨细胞丸 ＊ 肪细胞的～化口 ＊有地昭米寸 至抗坏丑I【I．酸丫在时，纯化的间质干细胞的生长具有以下特征：短暂诱导胁NZ磷酸酶之后是竹基质蛋白表达及钙沉积。因而BMSCS细胞培养为我们捉供了一个很好的6）［究成骨细胞分化调控的休外模fig。 金雀异黄酮哈eniste＊，Gen）足异茁酮类树物雌激索之－－－·，休外试验表明Gen是异黄酮类中雌激素样活性最高的一fI。。本实验选取Gen为研究对象，观察其对体外培养小鼠骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的诱导作川，初步探明 其作用杉理。2．实验方法2．l细胞培养 试验选取6E周昆明利’雌性小鼠（由小南大学湘雅医学院实验动物t卜心提供．），无菌操作分离股骨和胜骨，川6 号卡头禾含10％厂 牛＊消的Q仇EM培养基反复冲洗骨髓腔得到骨髓单个细胞悬液，低速离心，以含15％＊牛血清的。－MBM ：i悬，镜下卜数并调整细胞密度lx10 刁细胞／鸯仆后，禾板，置37”C、5％CO。培养箱内培养。5天后换液，改为成 仍·多化诱导培基S 含10％月 牛巾．清丸5＊＊＊11‘卜付 汕磷酸兑25；L’抗坏W 酸了。－M＊ 培养基（注为了避免培养基和血朽小口可方的雌 激素样活卜物顶 ＊后续试验的影响，诱导培丛。1’选取无酚红的。十BM和经过活件炭吸附的胎牛血清人 同时加入处理囚素并i；－为第0大，连续培养］2人，何2人加药一次，每4天换一次液。2．2实验设计2．2．l实验分组： ①溶媒对照组：二甲亚讽门．01们； ②Gen浓度梯度组：Gen（0．of，0．l，l，10umo1L ） ③各种主抗剂组：ICn82，78O（0．1卜m。卜卜’），4一羟基他 莫西丢 门八M0．1卜m＊卜’），氮位－矗基左旋精氨酸甲酯（I．－NAMB 3mo1L‘，6mol·L’），氮位－单甲基左旋精氨酸（L－NMMA lmol·L’），ODQ（ill mol·卜、 ④Gen mol·L斗各种乡抗齐乏； ⑤阳性对照组：17 p一雌二醇门0．01pmo卜L’人8一滨一环鸟分一磷酸（8－Br－cGMP 10卜mol·L’）； ③阳性对照十桔抗齐组：巳（O．m卜mI卜－’）十rI（0．1卜mo】卜）【（0．of 11 mol·L＊）十L－NAME（3mo1L＊），8－Br－cGMP（10 11 mol·L1）十 11 硕卜学仇沦义 中文七耍ODQ （ 11 mol·L‘）。2‘2．2检测主标 ①细胞增殖指标：厂H卜甲