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目的:动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理生理基础。为了有效地阻止动脉粥样硬化引起的损伤,人们对其机制已经进行了百余年的探究。目前关于动脉粥样硬化机制研究中,炎症反应学说占有主要地位,并得到学界的广泛认同。内皮细胞损伤发生在动脉粥样硬化早期,在动脉粥样硬化发生过程中起关键作用。内皮功能紊乱与肾素-血管紧张素系统(RAS)激活及相关的炎症机制在以动脉粥样硬化为病理基础的心血管疾病中起重要作用。RAS过度激活与多种疾病的发生发展密切相关,如高血压、动脉粥样硬化、心肌肥厚、细胞凋亡、心力衰竭及肾功能不全等。在经典的RAS中,血管紧张素Ⅱ(Angiotensin II,AngⅡ)被认为是最主要的损伤效应分子,它可以直接使平滑肌收缩,内皮素生成增加,并促进超氧阴离子的产生灭活NO;通过激活、招募炎症细胞到达受损血管表面,调节炎症反应;调节参与炎症反应的多种细胞间粘附分子、细胞生长因子及趋化因子等;还作用于一些核转录因子,间接调控炎症反应,加速动脉粥样硬化的进程。临床应用的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)类药物通过减少AngⅡ生成或抑制AngⅡ受体来抑制RAS,这对动脉粥样硬化起到了一定的治疗作用。临床研究结果显示似乎对RAS系统并未达到完全阻断,临床上也未取得令人满意的抑制动脉粥样硬化进展的治疗效果。最新RAS阻断剂—肾素抑制剂(Aliskiren)的研究发现其并不能阻断受体介导的信号通道的激活以及激活后受调节的转录因子对靶器官带来的损害,未能达到人们所预期的理想的RAS阻断效果。近年人们发现肾素(前体)受体[renin/prorenin receptor, (P)RR]是肾素和肾素前体共同的功能性受体。肾素和肾素前体与(P)RR活性位点结合后,分子构型发生了改变,其酶活性增加,直接激活有关的信号传导通路。由此发现了肾素和肾素前体可不依赖于传统的RAS激活而发挥生物学作用。由肾素、肾素前体和(P)RR组成的肾素(前体)受体系统被认为是RAS的新成员,成为人们研究的热点。本课题组前期实验证实在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中有肾素受体存在。肾素(前体)受体系统是否通过引起内皮细胞功能紊乱,进而参与了动脉粥样硬化的发生和发展,目前尚无相关报道。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),它是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。ERK1/2和p38通路是MAPKs信号通路中与炎症关系较为密切的信号通路,本实验以此为研究对象,探讨肾素(前体)激活(P)RR对相关炎症因子及氧化应激的影响。PI3K/AKT信号通路能直接磷酸化多种细胞因子,与血管壁细胞表型转换、增殖、迁移和肥大有关。因而认为PI3K/AKT信号通路可能参与动脉粥样硬化的发生发展。激活(P)RR是否能够影响PI3K/AKT信号通路的活化,并参与动脉粥样硬化相关炎症因子的表达,尚有待证实。人工合成的肾素前体前肽(HRP)是依据肾素前体前肽合成的10个氨基酸片段。一直被认为(P)RR阻滞剂,可以竞争性抑制肾素前体与(P)RR的结合。但是目前对HRP是否能够阻断(P)RR相关研究结果并不一致。利用在体外培养的HUVECs中,观察肾素(前体)激活(P)RR及干扰(P)RR后对ERK1/2及p38 MAPKs信号通路蛋白表达、血管细胞间粘附分子(VCAM-1)蛋白表达及超氧化物歧化酶(SOD)浓度的影响,探讨其对HUVECs的影响;同时观察在离体培养的HUVEC中,肾素前体能否通过(P)RR不依赖于AngⅡ直接调节细胞中PI3K/AKT,NFκB蛋白以及炎症因子IL-6的表达,并观察HRP是否存在(P)RR阻断功能。从分子机制探讨(P)RR在氧化应激及炎症反应中作用及机制,进而探讨(P)RR与动脉粥样硬化等伴有血管内皮损伤性心血管疾病的关系。方法:1.体外培养原代HUVECs,应用免疫组化检测Ⅷ因子相关抗原及流式细胞仪检测CD34分子进行细胞鉴定。2.在HUVECs中以siRNA干扰(P)RR,用RT-PCR方法检测干扰24,48及72小时后(P)RR的mRNA表达,确定干扰效率最佳时间点。3.以奥美沙坦和PD123319阻断Ang-Ⅱ受体AT1、AT2。分别以人重组肾素(renin)及肾素前体(prorenin)处理HUVECs,于处理后5,10,20,35,60,90分钟收取蛋白,用western blot法检测ERK1/2及p38信号通路蛋白磷酸化程度,确定肾素及其前体刺激致两信号通路蛋白磷酸化的最强时间点。4.以奥美沙坦和PD123319处理HUVECs 30分钟后,分别以人重组肾素及肾素前体刺激HUVECs,分别用western blot法,ELISA法和比色法观察肾素及其前体是否可使信号通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化增强、粘附分子VCAM-1表达增高、抗氧化酶SOD含量降低,以及干扰(P)RR表达后是否可阻断或减弱肾素及其前体的上述作用。5.以奥美沙坦(10-5M)和PD123319(10-4M)分别阻断HUVECs血管紧张素Ⅱ受体AT1、AT2,观察肾素前体(2×10-9M)对细胞中PI3K,p-AKT,NFκB-P65蛋白以及细胞上清液中炎症因子IL-6的影响。6.分别以(P)RR-siRNA干扰细胞(P)RR,以及三种浓度的HRP(1×10-6M,5×10-6M,10×10-6M)作用于细胞,观察各自对肾素前体引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表达的影响。7.以Wortmannin(0.5×10-6M)阻断PI3K/AKT信号通路,观察wortmannin对肾素前体引起的AKT激活、NFκB-P65和IL-6蛋白表达的影响。8.PI3K,p-AKT,p65蛋白通过western-blot检测。9.细胞上清液中IL-6的浓度用ELISA试剂盒检测。结果:1.CD34流式细胞鉴定,HUVECs百分率达98.35%,HUVECs免疫组化检测Ⅷ因子相关抗原阳性。2.RT-PCR结果证实(P)RR的mRNA在HUVECs中有表达,siRNA干扰(P)RR后72小时,(P)RR mRNA在HUVECs中表达最弱。3.经人重组肾素前体及肾素处理HUVECs后,信号通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平增强,在肾素作用于细胞后20分钟,ERK及p38磷酸化程度最强;分别在肾素前体作用于细胞后60分钟及35分钟,ERK及p38磷酸化最强。4.人重组肾素及肾素前体刺激HUVECs,可增高信号通路蛋白ERK1/2及p38磷酸化水平,上调粘附分子VCAM-1表达,降低抗氧化酶SOD含量。干扰(P)RR后上述作用明显受到抑制。5.肾素前体可以激活PI3K,P-AKT,上调P65蛋白和炎症因子IL–6的表达。6.(P)RR干扰可以抑制肾素前体引起的AKT激活及P65蛋白和炎症因子IL–6表达的上调。7.肾素前体引起的P65和IL-6表达增加不能被wortmannin所抑制。8.三种HRP浓度均不能抑制肾素前体引起的AKT激活及P65蛋白和炎症因子IL–6表达的上调。结论:1. (P)RR存在于HUVECs中。2.肾素及其前体通过(P)RR激活ERK1/2及p38 MAPKs信号通路,抑制SOD表达,上调炎症因子VCAM-1蛋白表达,该作用独立于AngⅡ。3.肾素前体可以激活PI3K/AKT信号通路,上调细胞因子表达,该效应不依赖于AngⅡ的作用。4.肾素前体通过(P)RR引起AKT磷酸化,并激活核转录因子P65,上调炎症因子IL–6表达。5.肾素前体激活P65和上调IL-6的表达可能不依赖于PI3K/AKT信号转导通路。6.不同浓度的HRP均无(P)RR阻断作用。