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目的我们以往的研究发现,在E-cadherin存在的情况下p120ctn能够影响肺癌细胞的侵袭和增殖能力,而且我们还发现p120ctn-1能够上调β-catenin,而p120ctn-3却不能,因此我们推测p120ctn-1A与3A影响肺癌细胞增殖的机制很可能是不同的。p120ctn-1很可能是通过β-catenin激活经典的WNT通路影响细胞的增殖,而p120ctn-3则很可能通过其他的因素而影响肺癌细胞的增殖。尽管已有文献报道p120ctn-3具有抑制细胞周期的作用,但p120ctn-3影响细胞周期的真正的分子机制还不十分清楚。Kaiso是作为p120ctn结合的配体而被发现的一种核BTB/POZ-ZF转录抑制因子,Kaiso能够识别DNA启动子上的特异性序列TCCTGCnA(即Kaiso-binding sites, KBS),抑制相应基因的表达。由于细胞周期蛋白cyclinDl启动子中也含有KBS序列,因此很可能是其潜在的下游靶基因。有趣的是,Kaiso与pl20ctn的结合部位—锌指结构恰恰也是它与KBS序列的结合部位。因此,我们设想：p120ctn-3很可能通过与Kaiso的结合,影响了Kaiso与KBS的结合,并影响Kaiso的核／浆分布,从而影响cyclinDl的转录,进而影响细胞周期。因此,我们通过过表达和干扰p120ctn,以及过表达和敲除Kaiso,分别探讨p120ctn-lA和3A通过Kaiso对肺癌细胞增殖和周期的影响。方法1、细胞培养肺腺癌SPC细胞系、A549细胞系购自ATCC。SPC和A549细胞分别在含有10%胎牛血清(GBICO Inc., NY, USA)的RPMI 1640培养基(GBICO Inc., NY, USA)和含有10%胎牛血清(GBICO Inc., NY, USA)的DMEM培养基(GBICO Inc., NY, USA)中培养(37℃,5% CO2)2、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium, MTT)法检测细胞增殖能力取对数生长期的肺癌细胞悬液进行细胞计数,分别接种于4个96孔板培养板。接种24小时后加入各种处理因素。处理后第24、48、72、96小时分别加入MTT(5mg/ml)20μl,继续孵育4小时后,每孔加入150μlDMSO溶解结晶,选择波长550nm在酶联免疫(ELISA)检测仪上测定各孔吸光度。3、流式细胞仪检测细胞周期收集对数生长期细胞制成1×107个／ml细胞悬液。取1ml细胞悬液75%冷乙醇于4℃固定过夜、离心后制成500μl的细胞悬液,加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分钟后上机检测,ModFitLT3.0软件分析细胞周期。4、RT-PCR转染48h后收集细胞,用Trizol Reagent (Invitrogen, CA, USA)提取后细胞的总RNA,具体操作步骤按说明书进行。用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa Biotechnology Co., Japan)逆转录获得cDNA,以反转录获得的cDNA为模板,分别扩增Kaiso、β-catenin、cyclinD1、cyclinE,以β-actin为内参。用NIH image软件分析产物条带灰度,以目的产物条带灰度值与β-actin产物条带灰度值的比值作为mRNA的相对表达量。5、Western blot收集细胞,提取总蛋白,蛋白定量。收集足量目的细胞,用皮尔斯公司核浆分离试剂盒,具体步骤按说明书严格进行,分别提取核／浆蛋白,蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上,然后用3%小牛血清封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2小时后ECL发光,曝光胶片后,蛋白条带经BioImaging Systems (UVP, CA, USA)采集后进行灰度值测定,目的蛋白灰度值与内对照β-actin进行标准化后即为其相对蛋白定量。6、ChIP在GENEBANK中查找出cyclinDl启动子基因序列(GenBank:AY439218.1),设计相应含有KBS序列的启动子片段引物(委托TAKARA公司完成),上游：5’-CCCT CTCATGTAACCACGAA-3’,下游：5’-TGGTTTTGTTGGGGGTGTAG-3’,退火55℃,扩增片段为179bp。用Upstate公司ChIP试剂盒,具体步骤按说明书进行。RT-PCT检测最终目的片段。7、免疫荧光染色接种细胞于24孔板中,PBS冲洗三次。4%的多聚甲醛于冰上固定,PBS冲洗三次。洗过后用0.2%的triton-X100于常温打孔15-30分钟,PBS冲洗三次。打孔后用1%的BSA常温封闭30分钟。封闭完后弃去封闭液加入一抗,p120ctn (1:200)和Kaiso羊多抗(1：100),4℃孵育过夜。PBS冲洗三次,在暗室中加入羊抗鼠二抗FITC(1：100),室温孵育1个小时,用PBS冲洗后,加入兔抗羊二抗TRITC (1:100),室温孵育1个小时,PBS冲洗后,加入Hoechstl:200稀释于PBS中,室温孵育3分钟,PBS冲洗后,用荧光显微镜观察。8、免疫共沉淀提取的蛋白中加入4μg的诱饵蛋白抗体,充分混匀后4℃孵育2小时后加入25μl Protein G Microbeads,混匀后继续4℃孵育1小时。按照操作说明步骤,混合液过μ柱,SDS上样缓冲液冲洗μ柱,收集免疫共沉淀产物,Western blot进行检测。9、统计分析使用SPSS13.0统计软件进行结果统计。所有以均数±标准差(X±SD)表示的数据,其实验至少重复3次,使用Mann-Whitney U test和Kruskal-Wallis test统计Western blot、RT-PCR、MTT assay、细胞周期及ChIP的结果。P值<0.05具有统计学意义。结果在A549和SPC细胞中,干扰总p120ctn细胞增殖能力显著降低,分别回复p120ctn-1和3亚型后均有效的回复了细胞的增殖能力；在A549和SPC细胞中,干扰总p120ctn,细胞G0／G1期细胞比例增高,S期细胞比例显著降低,分别回复p120ctn-1A或p120ctn-3A后,SPC-K2的G0/G1期细胞比例均明显下降,S期显著升高；在A549和SPC细胞中,p120ctn-1和3亚型均能有效上调cyclinDl和cyclinE的蛋白和mRNA水平；在SPC-K2细胞中分别瞬转回复p120ctn-1和3亚型后,kaiso的蛋白和mRNA水平没有变化,回复p120ctn-1后β-catenin的蛋白和mRNA水平显著上调,而回复pl20ctn-3后β-catenin蛋白和mRNA水平无明显改变；ChIP证实kaiso可以与cyclinDl启动子区的KBS序列结合；在A549和SPC细胞中,kaiso能够有效的调控cyclinDl和cyclinE的蛋白和mRNA水平；免疫共沉淀方法检测发现,在A549和SPC两种细胞系中p120ctn-3可以与kaiso结合,而未能检测出p120ctn-1与kaiso的结合；ChIP检测在A549中过表达p120ctn-1后kaiso与cyclinDl启动子结合情况无明显改变,而过表达p120ctn-3后kaiso与cyclinDl启动子结合明显减少,几乎检测不到；免疫荧光和核／浆分离蛋白检测发现,p120ctn-3能够有效调控kaiso的亚细胞定位,kaiso的出核依赖于p120ctn-3的出核转运。结论1、p120ctn-1和3亚型能够促进cyclinD1和cyclinE表达,影响细胞增殖与细胞周期。2、p120ctn-1通过β-catenin途径上调cyclinD1影响肺癌细胞增殖和周期。3、p120ctn-3A通过Kaiso途径上调cyclinD1影响肺癌细胞增殖和周期。