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目的:在糖尿病微环境中,晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对肾脏细胞产生损害作用,主要机制是通过诱导氧化应激和导致肾脏细胞上皮细胞间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)。我们用AGEs刺激肾小管上皮细胞,观察上皮细胞的EMT,并且检测细胞的AGEs受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)的表达及NF-κB的磷酸化水平的改变等。骨化三醇对肾脏有重要保护作用,但保护机制尚不明确。用骨化三醇对细胞进行预处理,进行相应的观察,以探讨骨化三醇是否对AGEs诱导的肾小管上皮细胞的EMT产生影响。方法:1.不同浓度的AGE-BSA(0、100、200、300μg/ml)与相应浓度的BSA孵育NRK52E细胞48h,Western blot检测上皮标志物E-cadherin间质标志物α-SMA以及AGEs特异性受体RAGE表达的改变。2.实验分组:空白对照组、低浓度(10nmol/L)骨化三醇组、高浓度(100nmol/L)骨化三醇组,Western blot检测经骨化三醇处理细胞后的E-cadherin和α-SMA的水平变化。3.实验分组:空白对照组,AGEs处理组、低剂量骨化三醇+AGEs处理组,高剂量骨化三醇+AGEs处理组。Western blot、荧光定量PCR、免疫荧光观察E-cadherin、α-SMA的表达变化及普通显微镜下细胞形态改变,并观察细胞RAGE的变化和NF-κB磷酸化的水平改变。4.实验分组:空白对照组,AGEs诱导组,50g/ml抗RAGE中和抗体+AGEs组,Western blot检测E-cadherin、α-SMA的相对变化。5.实验分组:对照组、AGEs处理组、100 nmol/L骨化三醇预处理+AGEs组、100 nmol/L骨化三醇+IMD0354预处理+AGEs组,Western blot检测RAGE的相对变化,荧光定量PCR检测RAGE的m RNA相对表达变化。6.SPSS 20.0统计软件做单因素方差分析组间差异。结果:1.不同浓度的AGEs孵育NRK52E细胞48h以后,上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物α-SMA以及AGEs特异性受体RAGE较空白对照组表达上调(P<0.05),并且具有浓度依赖性。2.分别低剂量(10nmol/L)和高剂量(100nmol/L)骨化三醇处理NRK52E细胞24h后,上皮标志物E-cadherin,间质标志物α-SMA表达并未有明显改变.3.Western blot、荧光定量PCR、免疫荧光都观察到一致结果,即:较空白对照组,AGEs组的E-cadherin显著下调(P<0.05),α-SMA显著上调(P<0.05),其结果能够被骨化三醇所逆转(P<0.05),高浓度较低剂量骨化三醇逆转程度高。AGEs组的RAGE、NF-κB磷酸化水平明显上调(P<0.05),但能被被骨化三醇所逆转(P<0.05),高浓度较低剂量骨化三醇逆转程度高。普通显微镜下,空白对照组的细胞形态呈多边形,AGEs组细胞形态呈梭形,骨化三醇+AGEs恢复到多边形形态。4.预先阻断RAGE,可扭转AGEs诱导的E-cadherin的显著下调以及α-SMA表达的显著上调(P<0.05)。5.RAGE的表达在AGEs较空白对照组显著上调(P<0.05),100nmol/L骨化三醇预处理+AGEs组较AGEs组,RAGE和上调水平下降(P<0.05),但较100 nmol/L骨化三醇预处理+AGEs组,100 nmol/L骨化三醇+IMD0354预处理+AGEs组,RAGE显著上调(P<0.05)。结论:1、用AGEs成功构建NRK52E细胞的上皮间充质转化模型。2、单独用骨化三醇刺激细胞,并未骨化三醇处理细胞并不能影响细胞的标志物表达水平的改变。3、骨化三醇可逆转AGEs诱导的细胞的EMT,并且可能是通过逆转AGEs诱导的RAGE、NF-κB磷酸化水平实现的。4、阻断RAGE,可阻断AGEs引起的细胞的EMT,说明AGEs诱导细胞的EMT是通过RAGE实现的。5、骨化三醇可降低RAGE的表达和NF-κB磷酸化水平,预先用NF-κB磷酸化抑制剂处理,可削弱骨化三醇对RAGE的降低水平。说明骨化三醇对RAGE水平的降低是部分通过NF-κB磷酸化实现的。