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研究背景神经病理性痛是由神经系统损伤或疾病造成的疼痛,其特点是原发损伤愈合后痛感仍然强烈、顽固、持久,给社会造成极大负担,给患者身心造成极大痛苦,尽管有些机制已经被认识,但鉴于临床治疗实际应用中发现还有很多问题亟待解决,进一步的研究尚需进行。早期生长反应因子1(Early growth respons1,EGR1)在体内调控多种靶基因的转录激活,同时也受到其他转录因子的调控和支配。以往研究报道表观遗传因子miR-124可能对EGR1蛋白表达具有负调控作用。最近研究证明EGR1参与学习与记忆相关的长时程增强和突触可塑性,并且EGR1在炎性痛、术后痛和神经病理性痛中也被证明发挥重要作用。但miR-124是否参与大鼠腰5脊神经结扎(lumbar 5 spinal nerve ligation,L5SNL)后EGR1在神经病理性痛的表达调控尚无报道。研究目的本研究采用L5 SNL模型,结合痛行为学实验和分子生物学技术,首先观察L5 SNL对大鼠背根神经节和脊髓背角中EGR1和miR-124表达的影响,证明EGR1在神经病理性痛中的作用。并且验证miR-124与EGR1的关系,再通过鞘内注射microRNA模拟物观察miR-124对EGR1在L5 SNL引起的神经病理性痛中的调控作用,其结果将从表观遗传学方向为神经病理性痛的治疗提供新的靶点。实验方法和结果1大鼠L5 SNL术后miR-124和EGR1在DRG和脊髓中的表达变化将实验用雄性SD大鼠随机分为实验组(L5 SNL组)和对照组(sham组),参照文献报道的方法进行L5 SNL手术,测量大鼠术前3天、1天和术后1天、3天、5天、7天、10天、14天后足机械撤足阈值(PWT)和热撤足潜伏期(PWL),发现与文献报道一致,大鼠术侧后肢PWT和PWL开始显著下降,第7天最低,并持续至第14天,模型建立成功。取sham组和术后1天、3天、5天、7天、14天大鼠术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓进行Western blot、RT-PCR和q-PCR检测EGR1表达量的变化。q-PCR检测miR-124表达量的变化。Western blot结果显示,L5 SNL后DRG和脊髓中EGR1的蛋白表达量升高,并且在第3天表达量最高。RT-PCR和q-PCR结果显示,L5 SNL后DRG和脊髓中EGR1的mRNA表达量升高,并且在第3天表达量最高。q-PCR结果显示L5 SNL后DRG和脊髓中miR-124表达量降低,并且在第3天表达量最低。以上结果表明L5 SNL引起大鼠术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓中EGR1蛋白和mRNA水平表达上调和miR-124水平下调。2大鼠L5 SNL后EGR1在DRG和脊髓背角表达的细胞类型采用免疫荧光组织化学技术对L5 SNL和sham大鼠的L4-5 DRG和脊髓进行染色拍照观察,单染结果发现L5 SNL可以引起EGR1在DRG和脊髓背角表达升高。进一步采用免疫荧光双染色技术观察EGR1在DRG和脊髓中表达的细胞类型,结果显示,EGR1主要分布在DRG中的有髓鞘的A纤维和无髓鞘的C纤维以及星形胶质细胞中,脊髓中主要分布在神经元和星形胶质细胞。3 miR-124和EGR1的靶标关系验证利用生物信息学技术和Target Scan Human 7.2预测miR-124和EGR1存在靶标关系。采用体外培养PC12细胞,并通过双荧光素酶实验验证miR-124是否与EGR1结合并负调控EGR1的表达。实验结果显示,不同剂量的miR-124 agomir(10 pM,50 pM,100 pM)和野生型(pmirGLO EGR1 3’UTR)共同转入PC12细胞,同转染scramble相比,miR-124 agomir在剂量50 pM时明显降低荧光素酶活性,说明miR-124与EGR1具有靶标关系。野生型(pmirGLO EGR1 3’UTR)载体与miR-124 agomir N.C,miR-124 antagomir等分别共转染到PC12细胞,突变型双荧光素酶报告基因载体(pmirGLO MUT EGR1 3’UTR)与miR-124 agomir,miR-124 agomir N.C,miR-124 antagomir等分别共转染荧光素酶活性没有明显变化,表明miR-124 agomir具有序列特异性。以上实验结果充分说明EGR1是miR-124的靶基因。4鞘内注射miR-124 agomir能够部分缓解L5 SNL引起的神经病理性痛,同时下调EGR1的表达大鼠L5 SNL术后立即鞘内注射miR-124 agomir(20uM,10ul),连续4天,并检测PWT和PWL。行为学数据表明,与L5 SNL+veh大鼠相比,L5SNL+agomir组大鼠术侧后肢机械性撤足阈值和热撤足潜伏期注药第2 d升高,持续至第4天,部分缓解神经病理性痛,对侧数值没有明显变化。Western Blot结果显示,与L5 SNL+veh组相比,L5 SNL+agomir组EGR1蛋白水平在DRG和脊髓背角表达降低。5正常大鼠鞘内注射miR-124 antagomir后致痛行为,同时上调EGR1的表达正常大鼠鞘内连续4天注射miR-124 antagomir(20uM,10ul),不同时间点检测PWL和PWT,行为学数据表明,naive大鼠相比,naive+antagomir组鞘内置管术后注药第1 d,大鼠术侧及对侧PWL和PWT明显降低,并持续至术后第4天。Western Blot结果显示,与naive组相比,naive+antagomir组EGR1蛋白水平在DRG和脊髓背角表达升高。6 L5 SNL大鼠鞘内注射特异性抑制EGR1碱基诱饵AYX1后缓解神经病理性痛行为为了进一步验证EGR1在神经病理性痛形成中的作用,我们在大鼠L5 SNL手术后立即一次性鞘内注射特异性抑制EGR1碱基诱饵AYX1(200nmol,15ul),检测术后不同时间点大鼠热撤足潜伏期(PWL)和机械刺激阈值(PWT),与SNL+veh组相比,大鼠术侧后肢在术后不同时间点一定程度上提高了热撤足潜伏期和机械刺激阈值,部分缓解了大鼠神经病理性痛。结论miR-124通过调控EGR1在大鼠背根神经节和脊髓背角中的表达参与L5SNL神经病理性痛。