研究背景前列腺癌（prostate cancer,PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一,在欧美发达国家其发病率居男性恶性肿瘤首位,致死率居第二位。我国前列腺癌发病率虽然远低于欧美国家,但随着社会经济的发展、生活方式和饮食结构的改变及人口老龄化社会的到来,前列腺癌发病率呈现出快速持续上升的趋势,1998-2008年间我国前列腺癌发病率年均增加比率达到了12.07%。自2008年起前列腺癌已成为我国泌尿生殖系统中发病率最高的肿瘤。在我国,早期局限性前列腺癌患者治疗主要以前列腺癌根治术（Radical prostatectomy,RP）为主,患者5年生存率能达到90%以上。然而,大多数前列腺癌患者病情较隐匿,早期无症状或症状不明显,且我国早期前列腺癌筛查尚未普及,因此,80-90%前列腺癌患者就诊时就已经是晚期前列腺癌,失去了手术治疗的机会。晚期前列腺癌具有很强的转移潜能,临床上对于前列腺癌转移主要采用雄激素去势治疗（Androgen Deprivation Therapy,ADT）。但大多数患者治疗效果并不理想,预后较差,中位生存期仅为20个月左右。肿瘤转移为临床前列腺癌治疗的主要障碍和患者死亡的主要原因。肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的获得是肿瘤实现远处转移的关键步骤,因此,研究与前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭相关的基因及分子作用机制,将为探索转移性前列腺癌药物治疗新靶点提供新的实验依据。ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factor, Arf）是Ras基因超家族成员,因Arf能够变构激活霍乱毒素,增强霍乱毒素的ADP-核糖基转移酶活性,促进霍乱毒素对Gs蛋白α亚基ADP-核糖基化作用而被发现。ADP核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6, Arf6）是Arf蛋白家族中最特殊的亚型,分子量约为20KD,主要分布于细胞膜和内涵体膜。在细胞膜内吞、胞外分泌、内涵体循环、细胞分裂、微囊泡运输和释放、细胞间粘附连接的形成和肌动蛋白细胞骨架重构等方面发挥着关键作用。近年来研究发现Arf6高表达于乳腺癌、黑色素瘤和神经胶质瘤等多种肿瘤组织和细胞中,并与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移密切相关。尽管目前关于Arf6调节各类肿瘤细胞运动、侵袭和迁移的具体作用机制尚不明确,但近10年来研究显示Arf6可能主要通过以下几个方面影响肿瘤细胞的恶性生物学行为：①破坏肿瘤细胞间粘附连接的形成,促进肿瘤细胞侵袭性表型产生,增强肿瘤细胞运动和迁移能力；②调节肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架重构,促进与肿瘤细胞迁移和侵袭相关的细胞膜突触结构形成,如板状伪足（lamellipodia）、树突状伪足（invadopodia）、丝状伪足（filopodia）、膜皱褶（membrane ruffles）和足体（podosome）等：③促进肿瘤细胞含各种蛋白水解酶的微囊泡的释放,增强肿瘤细胞对胞外基质蛋白的降解能力。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinases,PI3K）信号通路在细胞生长、存活、糖代谢、增殖、迁移和转移等生物学活动中扮演者重要角色,P13K通过激活其下游信号通路关键分子丝/苏氨酸蛋白激酶B （PKB/AKT）,促进细胞增殖、迁移和转移。研究发现Arf6调节胶质瘤细胞增殖与PI3K/AKT信号通路活化相关。胞外信号调节激酶（ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族成员,参与调节细胞增殖、分化、存活和凋亡。ERK磷酸化水平增加能够增强肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Arf6通过激活ERK信号通路能够促进胶质瘤细胞增殖,采用siRNA干扰Arf6表达,下调ERK磷酸化水平能够抑制细胞增殖。此外,在肝癌HepG2细胞中研究发现Arf6通过上调ERK磷酸化水平,激活下游效应蛋白Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-Related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）。 Racl是Rho家族成员,其表达增加能促进细胞运动和肌动蛋白细胞骨架重构,加速胞膜突触和膜皱褶的形成,增强肝癌细胞迁移和侵袭能力。虽然很多研究表明Arf6和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是目前尚未有报导前列腺癌细胞生物学行为与Arf6之间关系的研究。Arf6是否能够调节前列腺癌细胞株增殖、侵袭和转移及可能的作用机制,目前尚不清楚。研究目的本研究利用RNA干扰技术,下调Arf6表达,观察Arf6对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响,并初步探讨其相关分子作用机制。研究方法1、Arf6 siRNA序列设计和干扰效果检测：①根据NCBI数据库中Arf6基因序列（GenBank:NM₀01663.3）,由广州锐博生物设计合成3条针对不同靶向区域的Arf6特异性siRNA（small interference RNA）序列,siRNA干扰序列分别为:siRNA-1（792-810）, 5’-GGGACGCCAUAAUCCUCAUdTdT-3’（sense）,5’-AUGAGGAUUAUGGCGU CCCdTdT-3’（antisense）;siRNA-2（534-552）,5’-CAACAAUCCUGUACAAGUUdT dT-3’（sense）,5’-AACUUGUACAGGAUUGUUGdTdT-3’（antisense）, and siRNA-3 （950-968）,5’-CUCACAUGGUUAACCUCUAdTdT-3’（sense）,5’-UAGAGGUUAA CCAUGUGAGdTdT-3’（anti-sense）。②取对数生长期前列腺癌PC-3细胞株,细胞生长融合度达60-70%时,采用Lipofectamin（?）2000将上述siRNA转入前列腺癌PC-3细胞株内,并通过Real Time-PCR和蛋白质印迹（western blot）法分别检测3条不同siRNA对PC-3细胞Arf6 mRNA和蛋白干扰效率,筛选出干扰效果最佳的siRNA序列；最后,采用同样的方法确定该siRNA序列的最适作用浓度和作用时间。2、MTT法检测细胞增殖：将细胞分为三组：siRNA-3组、阴性对照组（NC）和正常对照组（Con）,采用噻唑盐（MTT）法分别检测siRNA-3转染48、72和96小时后,各组PC-3细胞OD490 nm吸光度值,绘制生长曲线,并计算siRNA-3组细胞抑制率。细胞存活率（%）=[OD（实验组）-OD（空白组）/OD（对照组）-OD（空白组）]×100%；细胞抑制率（%）=1-细胞存活率（%）。3、划痕愈合实验：取对数生长期的PC-3细胞接种至6孔细胞培养板,转染siRNA 48小时形成单层细胞后,进行划痕愈合实验,用含1%FBS的培养基继续培养。分别于划痕后0h、6h、12h和18h进行拍照,每孔随机选取5个视野,观察细胞迁移距离和划痕愈合率。细胞迁移距离=（划痕宽度0h-划痕宽度xh）/2；划痕愈合率=[（划痕区域面积0h-划痕区域面积xh）/划痕区域面积0h]×100%。4、Transwell侵袭实验：采用未包被和包被Matrigel基质胶的Transwell小室检测单个PC-3细胞迁移和侵袭能力。Transwell小室内分别培养24和48小时后,取出小室4%多聚甲醛固定15分钟,1%结晶紫染色10分钟,PBS清洗风干后,显微镜下随机选取5个视野进行细胞计数（100×）。5、Arf6信号通路相关蛋白的检测：为了进一步探讨siRNA-3干扰Arf6抑制前列腺癌细胞株增殖、迁移和侵袭可能的分子机制。我们采用蛋白质印迹法检测了Arf6调节肿瘤细胞生长和侵袭相关的PI3K/AKT和ERK/Rac1信号通路中关键信号分子AKT、p-AKT、ERK1/2、 p-ERK1/2和Rac1在各组PC-3细胞中的表达情况。6、统计学分析方法：各独立实验均重复3次,采用SPSS19.0软件进行统计分析,实验数据以x±s表示,两两比较用t检验,各组间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、siRNA-3抑制前列腺癌PC-3细胞内源性Arf mRNA和蛋白的表达①与空白对照组相比,转染阴性对照序列对PC-3细胞内源性Arf6的RNA和蛋白表达无明显影响（P>0.05）。3条特异性Arf6 siRNA靶向序列（siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3）均不同程度的抑制了PC-3细胞Arf6 RNA和蛋白的表达,其RNA抑制率分别为（34.82±4.79）%、（56.85±1.52）%和（91.88±3.13）%,蛋白抑制率分别为（25.73±1.25）%、（67.11±1.08）%和（86.37±0.57）%。其中siRNA-3对前列腺癌PC-3细胞内源性Arf6干扰效果最好（P<0.05）。②转染不同浓度的siRNA-3（10nmol/L、20 nmol/L和50nmol/L）至PC-3细胞内,转染48小时后,采用上述方法检测不同浓度siRNA-3的干扰效果,结果发现siRNA-3（50nmol/L）能显著抑制PC-3细胞内源性Arf6的表达（P<0.05）,并且这种抑制效应能够持续到细胞转染后96小时,表明siRNA-3对PC-3细胞内源性Arf6的抑制效应呈剂量和时间依赖性。2、siRNA-3干扰Arf6表达抑制前列腺癌PC-3细胞增殖利用噻唑盐（MTT）法分别检测siRNA-3、NC和Con组PC-3细胞siRNA转染后不同时间点（48、72、96小时）的OD490 nm值,绘制细胞生长曲线,计算siRNA-3组细胞抑制率。siRNA-3转染后不同时间点（48、72、96小时）对PC-3细胞抑制率分别为（10.68±0.04）%,（16.51±0.04）%和（26.35±0.03）%,与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）。siRNA-3对PC-3细胞增殖的抑制在转染96小时后最为显著,并具有时间依赖性。3、siRNA-3干扰Arf6表达抑制PC-3细胞的迁移和侵袭能力①划痕实验检测siRNA-3干扰Arf6表达对PC-3细胞迁移能力的影响,结果发现划痕18小时后,Con和NC组PC-3细胞迁移距离和划痕愈合率差异均无统计学意义（P>0.05）,而siRNA-3组细胞迁移距离较对照组明显减少（P<0.001）,而划痕愈合率仅为对照组的45-50%（P<0.05）。②Transwell体外迁移实验结果显示siRNA-3组穿过transwell小室的细胞数较对照组减少了61.61%（P<0.05）,而正常对照和阴性对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。Matrigel基质胶包被的transwell小室侵袭实验结果显示：siRNA-3组穿过Transwell小室膜的细胞数较对照组减少了89.44%（P<0.05）,而正常对照组和阴性对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。表明siRNA-3干扰PC-3细胞内源性Arf6表达能够有效抑制细胞体外迁移和侵袭能力。4、 siRNA-3干扰Arf6表达抑制p-ERK1/2和Rac1表达蛋白质印迹法检测结果显示siRNA-3下调Arf6表达后,PC-3细胞内p-ERK1/2和Rac1蛋白表达水平较对照组明显降低,而AKT、p-AKT和ERK1/2蛋白表达水平较对照组差异无统计学意义。表明siRNA-3下调Arf6表达抑制PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力可能与p-ERK和Rac1表达下调相关。结论1、特异性siRNA-3能够显著抑制人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞内源性Arf6的mRNA和蛋白表达。2、Arf6表达下调后,前列腺癌PC-3细胞体外增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。3、Arf6表达下调抑制PC-3细胞增殖、迁移和侵袭,其可能与ERK1/2磷酸化和Rac1表达下调相关。