随着经济的发展、生活的改善和全球对食品安全及营养问题的日益重视，有机食品、绿色食品、功能食品、保健食品等，已成为世界各国食品工业新的增长点。功能性低聚糖作为一种新型的功能性食品添加剂，因其独有的生理功能及卓越的物化性质，备受消费者的信赖和追捧。酶的应用是功能性低聚糖制备的重要方法。酶法合成功能性低聚糖的关键是生物催化剂—酶制剂。不同来源的酶合成不同产量、结构和组成的功能性低聚糖。因此，寻找各种高转糖基活性、酶学性质稳定、安全性好的酶源，不断开发具有更强益生功效的新型低聚糖，一直是功能性低聚糖研究的重点。乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）被公认为是安全的(generallyregardedassafe，GRAS)食品级微生物，其产生的β-半乳糖苷酶也相应地被认为是安全的，无需纯化即可直接用于酶法合成功能性低聚糖。作为一种优质的酶源，关于利用LAB来源β-半乳糖苷酶来合成功能性低聚糖的报导却相对较少，且缺乏系统的研究。　　本论文从实验室分离保藏的148株LAB入手，筛选到的一株产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的LAB;采用多种色谱分离技术联用，分离纯化得到纯酶，然后研究了该酶的酶学性质，酶法合成低聚半乳糖(GOS)和异低聚半乳糖(HeOS)的反应条件和产物结构组成，以及这些功能性低聚糖体外增殖肠道益生菌的作用，为其进一步的开发与应用提供了必要的工作基础和科学依据。主要结果如下:　　1.产转糖基活性β-半乳糖苷酶LAB的筛选及其超声提取条件优化　　采用X-Gal蓝白斑平板初筛，从实验室分离保藏的148株LAB中得到43株具有β-半乳糖苷酶活性的LAB;薄层层析(TLC)复筛，得到7株具有较高转糖基活性的β-半乳糖苷酶的LAB;气相色谱(GC)准确定量转糖基产物，从中确定一株转糖基活性最高的β-半乳糖苷酶的产出菌株70810，产率达到39.2％(w/w);菌株70810为实验室已鉴定LAB，为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）。选定L.plantarum70810作为进一步的研究对象，考察了菌悬液浓缩倍数、超声功率、提取时间等因素对酶活力的影响，并采用正交设计的方法优化得到最佳提取条件，即菌悬液浓缩5倍，超声功率为400W，工作/间歇时间为15s/10s，提取总时间为25min。在此条件下，最终酶活力为5.85±0.11U/mL。在优化后提取条件下，绘制了L.plantarum70810发酵产酶曲线，发现该产酶模式属于中期合成型，并确定发酵产酶时间为20h。　　2.L.plantarum70810β-半乳糖苷酶分离纯化及其酶学性质的研究　　从L.plantarum70810来源的β-半乳糖苷酶粗酶液出发，先后经过40～65％饱和度硫酸铵分级沉淀、SephacrylS-300凝胶层析、Mono-QTM离子交换层析和Superdex200凝胶层析，各步骤分别采用Native-PAGE和SDS-PAGE电泳测定其纯度，最终得到电泳纯的β-半乳糖苷酶。该酶是由两个亚基(35KDa和72KDa)组成的异源二聚体。酶纯化后的比活力为196U/mg、纯化倍数为50.3倍、回收率为9％。　　酶学性质研究表明:以oNPG和乳糖为底物，L.plantarum70810来源的β-半乳糖苷酶的最适合温度分别是60℃和55℃，最适pH均是8.0。该酶在不高于45℃条件下比较稳定，其pH稳定范围是6.5～8.0，37℃条件下保温48h，相对酶活保持在70％以上。该酶水解oNPG和乳糖的米氏常数Km分别为0.89±0.05mM和9.88±0.16mM，最大反应速率Vmax分别为194±3.0μmoL/min/mg和15.88±0.21μmoL/min/mg。10mM的Ca2+，Zn2+，Mn2+，Al3+和EDTA对该酶有显著抑制作用，而Na+，K2+和Mg2+在较低浓度有轻微促进作用。乳糖水解产物葡萄糖和半乳糖对该酶有轻微抑制作用。　　3.酶法合成低聚半乳糖及其GC-MS鉴定和条件优化　　采用气质联用(GC-MS)的分析手段，对来源于L.plantarum70810β-半乳糖苷酶酶法合成的GOS产物进行了鉴定，共确定9种低聚二糖和3种低聚三糖，主要连接结构为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。　　通过对乳糖浓度、反应温度、体系pH以及酶浓度等反应条件进行研究，监测低聚糖合成反应的全过程，确定了酶法合成总GOS，及其各主要组分产量的最优条件。乳糖浓度和反应温度的变化对于产物的合成影响较大，为主要的影响条件，而体系pH和酶浓度对于各产物最高产量的影响不显著，为次要影响条件。经过对反应条件进行优化，总产量与各组分产量的最优条件一致，为底物浓度400g/L，体系pH7.0，10U/mL的酶浓度，45℃水浴10h。总GOS产量达到177.2g/L，在体系中占44.3％(w/v)。其中异乳糖、6-半乳二糖、6-GOS和3-GOS的产量分别是63.2g/L、15.3g/L、72.2g/L和25.1g/L。　　利用廉价的乳清粉代替乳糖，并采用原位合成的工艺酶法合成GOS，其最高产量在18h达到最高，约为32.05％(w/w)。在组成和结构上，该GOS混合物与以纯乳糖为底物合成的GOS基本一致。　　4.酶法合成异低聚半乳糖及其分离纯化和结构鉴定　　用L.plantarum70810的β-半乳糖苷酶作为催化剂，分别以乳糖和纤维二糖、蜜二糖、麦芽糖、海藻糖等常见二糖为混合底物进行酶法合成HeOS。通过活性炭-硅藻土吸附层析的方法进行分离纯化，利用GC和GC-MS监测整个合成与纯化过程，得到五种不同的HeOS纯品。将纯品通过NMR分析，并进行结构表征。结果表明，来源于L.plantarum70810β-半乳糖苷酶催化混合底物反应，专一性地以β(1→6)糖苷键将乳糖水解得到的半乳糖基转移到不同糖分子受体上。五种产物分别为:β-D-Galp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→4)-α，β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→6)-α，β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→1)-β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glc-ol/Man-ol和β-D-Galp-(1→6)-a-D-Glcp-(1→2)-α-D-Fruf（6-乳果糖），其中除乳果糖之外，经Scifinder检索，其它四种物质前人未见报道，为合成后首次命名。　　5.不同结构和组成的功能性低聚糖对肠道乳酸菌体外增殖的研究　　以L.plantarum70810的β-半乳糖苷酶作为催化剂，分别以乳糖和纤维二糖、乳糖和蜜二糖、乳糖和海藻糖、乳糖和麦芽糖醇、乳糖和蔗糖为混合底物酶法制备了不同结构和组成的GOS和HeOS，分离纯化去除了混合物中的非功能性组分，并采用GC对各组分进行了定量。然后将这些GOS和HeOS分别作为唯一碳源，以商品化Lactose和GOSQHT作为参照，对不同来源的10株LAB进行纯培养并绘制其生长曲线。通过考察最大生长密度(OD600)、最大比生长速率（μmax）和延滞期(lag)等指标，研究这些不同结构和组成低聚糖体外增殖LAB的作用效果。结果表明，由于不同LAB的生长繁殖存在个体差异，不同GOS和HeOS对不同LAB表现出了不同的增殖效果。但综合上述几项指标的评价可以发现，与商品化的GOSQHT比较，除对W.hellenicaLe3-1和L.brevisM3-11的增殖作用相当，HeOS-1、HeOS-2、HeOS-3和HeOS-5对其他LAB的益生功效突出，最大生长密度和最大比生长速率均优于GOSQHT，且生长延滞期也相对较短;而以HeOS-4作为碳源，不同LAB均表现出较低的生长密度和生长速率，但其生长延滞期均是最短的，表明HeOS-4具有优先被LAB利用的能力。