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核酸标准样品是指核酸扩增技术中使用的标准样品,对促进致病性核酸扩增检测方法的标准化,提高检测结果的一致性和准确性具有重要作用。我国在核酸标准样品的研制方面刚刚起步,数量和种类也远远不能满足当前市场及监督检验的需求。大肠杆菌是全世界范围内常见的致病菌,目前仍缺少其毒力基因监测相关质粒DNA标准样品,因此本研究将以此为目标开展。本文通过对大肠杆菌中常见毒力基因esc V、stx2、hlyA、rfb、uid和eaeA引物进行PCR扩增,分别得到其扩增产物,通过琼脂糖凝胶纯化目的基因片段,克隆至载体p LBsimple Vector中,构建含目的基因片段的重组质粒;通过菌落PCR和测序对重组质粒进行验证,菌落PCR结果显示转化成功率为100%,将测序结果与Gen Bank上已公布的基因序列进行比对,结果除了uid重组质粒比对率为99.6%,其余测序结果比对率为100%,表明重组质粒都构建成功;建立PCR反应体系,对质粒标准品进行检测限和特异性实验,结果显示检测灵敏度可以达到pg级别,质粒标准品都具有特异性;进行传15代测序,测序结果也相同,表明构建的质粒标准品具有稳定性;选取esc V、stx2、hly A质粒标准品进行冻干粉制备,采用PCR对冻干粉进行检测限实验,检测限分别为3.93×106拷贝·?L-1、2.41×105拷贝·?L-1和2.14×105拷贝·?L-1;对esc V、stx2和hly A质粒标准品冻干粉样品进行均匀性检测,结果显示冻干粉之间不存在显著性差异,样品均匀性较好;随机取esc V、stx2和hly A质粒标准品冻干粉样品各30管置于25℃、4℃和-20℃ 3个温度保存,在固定时间分别取3个温度下样品进行稳定性检验,浓度测定结果表明质粒标准品冻干粉具有很好的稳定性,并通过PCR反应对冻干粉性质进行测定,PCR结果显示在3个温度下冻干粉的性质稳定;将构建的大肠杆菌常见毒力基因esc V、stx2和hly A的质粒标准品作为阳性对照,对36批枸杞子样品进行PCR检测,结果在34批样品中均没有esc V、stx2被检测出,检出率为0;3批枸杞子样品中检测出hly A,检出率为8.82%。此后选择PCR检测结果为阳性的3批枸杞子样品进行传统微生物分离鉴定,结果没有检测出大肠杆菌。传统微生物检测方法中使用的增菌液没有针对性的对目的菌进行增菌,推测在微生物污染环境下,目标致病菌的生长可能被抑制,导致检出率大大降低。本课题以食源性微生物大肠杆菌为研究对象,构建大肠杆菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品,在大肠杆菌检测中可作为阳性对照和参考物质,并将其应用于中药枸杞的微生物检测。