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研究目的
利用生物信息学方法对新发现的华支睾吸虫19kDa分泌蛋白(C．sinensis19kDa secretory protein，CsSP19)和华支睾吸虫睾丸分泌蛋白(Csinensis testieularsecretory protein，CsTSP)两个基因编码的蛋白进行结构和功能预测，并利用基因工程技术进行克隆和表达，获得相应的重组蛋白，初步研究重组蛋白的免疫学特性，探讨其作为诊断候选抗原分子的潜在价值。
研究方法
1．华支睾吸虫成虫CsSP19和CsTSP的生物信息学分析从华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库的Unigene的全长基因中筛选出CsSP19和CsTSP，利用生物信息学技术对CsSP19和CsTSP的cDNA序列进行结构和功能分析与预测，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析；对推导的蛋白进行理化性质、信号肽、亲水性分析及功能域和二、三级结构分析。
2．CsSP19和CsTSP两基因的克隆、表达和纯化2．1 CsSP19和CsTSP基因的扩增、克隆：根据目的基因的ORF设计引物，以相应的文库质粒为模板扩增出目的片段，用定向克隆方法分别将CsSP19目的片段插入表达载体pET-28a(+)、将CsTSP目的片段插入pGEX-4T-1中，构建的重组质粒分别用PCR、双酶切及测序进行鉴定。 2．2 重组蛋白的表达和纯化：将重组质粒pET-28a(+)-CsSP19和pGEX-4T-1-CsTSP分别转化入大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达融合蛋白，CsSP19重组包涵体蛋白经SDS溶解变性后用His亲和层析柱进行纯化，含GST的CsTSP融合蛋白包涵体通过切胶、电泳回收进行纯化。
3．重组蛋白的免疫学功能研究
3．1 CsSP19重组蛋白的免疫学功能研究
3．1．1免疫血清的制备：
用纯化的CsSP19免疫大鼠，制备大鼠抗CsSP19的免疫血清并进行血清预吸附。
研究结果
1．CsSP19和CsTSP的生物信息学分析
1．1 CsSP19基因全长688bp，最大的开放读码框(ORF)含564bp，编码188aa，起始密码ATG，终止密码TAG，理论分子量和等电点分别为21.2kDa和8.02。BLASTX分析CsSP19基因与目前GenBank中已知基因序列的同源性均不高，其中同源性最高为日本血吸虫一些未知蛋白，一致性为31﹪，相似性47﹪，Score值87，推测它是华支睾吸虫功能未知的新基因。保守功能域分析该序列含甾体运输蛋白结构域(sterol carrier protein type,SCP)，SignalP显示该蛋白含有信号肽序列，剪切位点在第20-21位氨基酸之间。PredictProtein预测CsSP19二级结构中共有4个α-螺旋、3个β-折叠、13个无规则卷曲，它们在蛋白中所占的比例分别为29.79﹪、11.70﹪、58.51﹪，无跨膜区。三级结构表明蛋白分子呈球状，62.23﹪的氨基酸残基暴露于表面，其余位于内部；其可能的抗原表位分别位于成熟蛋白的aa61-aa66、aa63-aa69、aa151-aa156。
1．2 CsTSP基因全长702bp，最大的ORF含450bp，编码150aa，起始密码ATG，终止密码TAA，，理论分子量为16.48kDa，等电点PI为6.39。BLASTX分析与CsTSP同源性最高为日本血吸虫功能未知蛋白(登录号：56752713)，一致性达50﹪，相似性达67﹪；CsTSP与多个物种的附睾分泌蛋白有一定的同源性：其中与热带爪蟾同源性达40﹪；与人的同源性为35﹪。SignalP显示CsTSP也含有信号肽序列，剪切位点在第17-18位氨基酸之间；功能域分析CsTSP含有参与脂类的识别和转运的Npc2样蛋白结构域和与变态反应相关的Der P 2样结构域等。CsTSP的二级结构中有1个α-螺旋、7个β-折叠、12个无规则卷曲，它们在蛋白中所占的比例分别为．10.07﹪、41.61﹪、48.32﹪；CsTSP无跨膜区。其可能的抗原表位分别位于成熟蛋白的aa113-aa118、aa115-aa121。
2．CsSP19和CsTSP基因的克隆、表达和纯化
利用两基因的特异性引物扩增出CsSP19和CsTSP目的片段，定向克隆获得的重组原核表达质粒pET-28a(+)-CsSP19和pGEX-4T-1-CsTSP经PCR、双酶切和测序证实构建成功。重组质粒在IPTG诱导下以包涵体形式成功表达出融合蛋白，经SDS-PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量相符。SDS-PAGE显示CsSPl9重组蛋白经His亲和层析柱纯化成功；CsTSP-GKT融合蛋白经切胶纯化成功。
3．重组蛋白的免疫学功能研究
3．1 CsSP19重组蛋白的免疫学功能研究纯化的CsSP19蛋白免疫大鼠，获得了大鼠抗CsSP19免疫血清。Westernblotting证实CsSP19重组蛋白能被蛋白免疫血清和华支睾吸虫病人血清识别，具有免疫原性和抗原性；此外，通过Western blotting观察到：CsSP19免疫血清能识别华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原中约18.4kDa的组分，与CsSP19去除信号肽后成熟蛋白理论分子量19kDa大小相接近，从而证实CsSP19是分泌排泄抗原中的组分。同时，间接免疫荧光显示在虫体组织结构中并未出现特异性荧光，表明CsSP19并非为虫体结构蛋白，进一步提示CsSP19可能为虫体的分泌/排泄蛋白。
通过ELISA检测33例阳性病人血清中不同抗体类型的OD值显示：IgG<,1>的平均OD值最高(0.834±0.65)，IgG<,2>次之(0.148±0.109)，而IgG<,4>、IgA、IgE的反应值极低。以重组CsSP19蛋白作为诊断抗原检测病人血清IgG<,1>水平时，敏感性达72.22﹪(39/54)，与检测血清总IgG的敏感性71.21﹪(47/66)相接近。通过对不同感染度病人血清总IgG的检测发现：重组CsSP19用于轻中度感染诊断的敏感性较好，为81.25﹪(39/48)，而检测重度和超重度病人敏感性较差。通过对非流行区人群血清和流行区健康人群血清总IgG的ELISA检测发现，阴性诊断率分别为86.90﹪和97.67﹪，显示出重组CsSP19用于诊断具有较好的特异性。
3．2 CsTSP-GST融合蛋白的Western blotting鉴定Western blotting显示CsTSP-GST融合蛋白能被处理组免疫血清和大鼠感染血清所识别，而对照免疫血清和阴性大鼠血清不能识别融合蛋白，可以提示两点：(1)、切胶得到的用以免疫处理组大鼠的抗原确实是纯化的CsTSP-GST融合蛋白，且其所得的免疫血清中的抗体是针对融合蛋白线性抗原表位的特异性抗体；(2)、融合蛋白具有免疫原性和抗原性，含有线性抗原表位，可作为免疫诊断的候选抗原。此外，Western blotting显示融合蛋白免疫血清能识别单独的GST标签蛋白，表明融合蛋白免疫血清中存在针对GST表位的抗体。
研究结论
1 CsSP19重组蛋白具有免疫原性和抗原性。
2 CsSP19并非虫体结构蛋白，可能是虫体的分泌蛋白，是华支睾吸虫分泌排泄抗原组分之一。
3 CsSP19刺激机体产生的抗体亚类以IgG<,1>为主。
4 重组CsSP19用于华支睾吸虫血清学诊断的敏感性约71.21﹪，对轻度和中度感染的敏感性要高于重度感染，特异性达97.67﹪，具有较好的诊断应用价值。
5 纯化的CsTSP-GST融合蛋白具有免疫原性和抗原性。